实验十二 植物中DNA的提取及鉴定

实验十二植物中DNA的提取及鉴定

一.实验目的

1.学习掌握从植物中提取DNA的方法

2.学习掌握从植物中分离核酸的原理和方法

二.实验原理

Ⅰ植物基因组DNA 的提取（CTAB法）

植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide，简称CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。

在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：

（1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。（2）抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节pH，使偏碱（pH8.0）；

c、抽提液中加表面活性剂；

d、加螯合剂（EDTA）除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失。

（3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综合考虑，取pH8.0左右为宜。

（4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，其分子量可达1012道尔顿，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。

（5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。

分离提取植物DNA的方法很多，本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法和电泳鉴定。

三.材料与方法

（1）取200mg样品(在液氮中研磨成粉末状)放入1.5mL离心管中，加入600μL DNA提取液，颠倒混匀5-6次。65℃保温35分钟以上，其间颠倒混匀一次。

（2）再加等体积的氯仿异戊醇(24：1)溶液轻轻摇晃30秒，在4℃下10000rpm/分钟离心10分钟后，取吸上清液(450μL)

（3）再加两倍体积的预冷异丙醇，混匀静止10分钟以上，在4℃下10000rpm/分钟离心10分钟后，弃上清。

（4）用600μL70%乙醇洗涤沉淀，重复一次，在室温下倒置晾干。

（5）沉淀用TE溶液溶解DNA，再加入RNase至终浓度50μg/mL，在37℃下保温半小时，将DNA样品放入冰箱保存。

嘌呤碱基的鉴定

取1试管，取1mL0.1mol/LAgNO3液(逐滴加入氨水至沉淀消失)，然后加入1ml水解液旋转片刻。观察有无白色沉淀产生

磷酸的检测

取1ml水解液加入8滴浓硝酸和1ml钼酸铵置沸水浴中加热8min，观察颜色变化及沉淀状况.

脱氧核糖捡测

取1ml水解液加入等体积的二苯胺试剂，于沸水浴中加热8min , 观察颜色变化。

四.结果与分析

第一支试管出现白色沉淀，

第二支试管出现棕色沉淀，

第三支试管出现浅蓝色。

分析：由于嘌呤碱基存在，与银离子结合生成白色沉淀；磷酸与在浓硝酸作用下，与钼酸铵反应变为黄色，硝酸氧化使颜色加深变为棕色；脱氧核糖与二苯胺反应，溶液变为蓝色. 五.讨论与结论

实验结果与前人所做相同，本次实验成功.

六.思考题

1、核酸分离时为什么要除去小分子物质和脂类物质？本实验是怎样除掉的？

答：分离纯化的目的就是得到尽可能纯的东西。用于分子生物学目的的核酸中如果混有小分子或者脂类物质或者其他杂质都是有可能对后续步骤产生影响的，比如说使限制酶失活或者改变特异性等等。

2、实验中呈色反应时RNA为什么能产生绿色复合物？DNA产生蓝色物质?

答：加热后的DNA能够与二苯胺产生蓝色的颜色反应

戊糖转化成糠醛,其可与地衣酚生成绿色复合物。

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