对药物胎盘转运体外模型探究

bewo细胞模型

概述来源于人类恶性绒毛膜癌的3种滋养层细胞系(bewo,jar和jeg)表达了侵袭子宫的滋养层细胞的很多生物化学和形态学特征,因此这些细胞系被用来作为模拟胎盘屏障的模型[6]。其中,bewo细胞系是最早建立的滋养层细胞系,已经被证明是研究药物和营养物质通过滋养层跨细胞转运最有意义的模型,因为其能在相对较短的时间内通过传代维持并生长为与胎盘滋养层相似的融合的细胞单层,可以表达与典型的滋养层相同的激素分泌特性以及体现妊娠晚期滋养层的很多特性[7],还与胎盘屏障存在相似的转运体,在顶侧和基底侧存在atp-结合盒(atp-bindingcassette,abc)转运体和可溶性载体(solutecarrier,slc)两大家族中多种转运蛋白的表达[8]。模型的制作方法及鉴定bewo细胞多用含胎牛血清(fbs,10%)、l-谷氨酸盐(1%)、青霉素(1×104u/ml)、链霉素(100mg/l)的dmem/f-12培养液培养(37℃、5%co2),传代后将其接种于transwell小室(transwellinsert)或millicell小室(millicellinsert,孔径0.4μm)的碳酸酯膜上,待细胞生长为具有屏障性质的融合层即可使用。跨bewo细胞的转运实验一般在transwell小室或水平扩散池(side-by-sidediffusioncell)中进行。在细胞层的顶侧加入含有待测药物的hank′s平衡盐溶液,在基底侧加入空白hank′s平衡盐溶液(或相反操作),培养过程中定时从基底侧(或顶侧)取样,测定两侧药物含量,计算出药物的表观通透系数(papp)[9]。bewo细胞单层的完整性和功能性可通过以下指标评价[7,10]:①细胞形态学观察。电子显微镜或透射电镜观察单层细胞融合性和细胞间紧密连接,在细胞培育4~6d时,切除碳酸酯膜,透射电镜观察横纵切面,可见细胞呈现连续单层,此时的细胞单层即可进行跨膜转运实验。②bewo细胞单层的跨膜电阻(transepithelialelectricalresistance,teer)。在细胞培育4~6d,teer约达60ω?cm2时,细胞单层即可进行跨膜转运实验。③漏出标记物被动扩散的跨膜通量。通常用甘露醇、葡聚糖t70、荧光素等荧光或放射性标记物,考察一定时间内bewo细胞单层对低分子和高分子漏出标记物的透过情况。模型的应用及评价到目前为止,bewo细胞系已经成功用于研究多种营养物质和化合物的不对称的跨细胞转运,包括氨基酸、葡萄糖、胆固醇、叶酸、脂肪酸、转铁蛋白、血清素、胆碱和免疫球蛋白等。近年来,利用该模型研究了多种营养物质、药物、有毒物质等的跨胎盘转运[11-13]。bewo细胞是目前研究滋养层转运和药物代谢的有效模型,不足之处在于bewo细胞不能自发分化为合体滋养层,不能模拟人胎盘屏障结构在妊娠期呈现的动态变化过程。而且体外培养胎盘合体滋养层细胞需要的费用较高,实验周期长,对实验室的设备和条件要求也较高。

胎盘组织模型

概述胎盘组织培养操作简便、快捷,对实验室的设备和条件要求不高,易于开展,且妊娠各期胎盘组织均可获得并进行培养。体外培养的胎盘组织可以用来研究母体胎儿许多方面的相互关系,如转运、酶功能、营养物质和异生物质代谢[14]。目前可用于研究药物胎盘代谢和转运的胎盘组织模型有绒毛模型和质膜囊泡模型两种。模型的制作方法及鉴定胎盘绒毛组织从胎盘分离后被剪切为2mm大小的碎片,于含有药物或营养物质的培养基中孵化(通常进行放射性标记),以进行这些药物胎盘摄取的评价。培养一段时间后,组织碎片在蒸馏水中移除、洗涤和裂解,以释放放射性底物,使用闪烁计数法分析结果。胎盘绒毛模型可在体外维持组织结构完整性至少达3h,通过检测微绒毛边缘膜、合胞体和质膜的完整性,胎盘催乳素和雌二醇的分泌率,以及乳酸脱氢酶的释放水平来评价绒毛的完整性和功能性[15-17]。模型的应用及评价合体滋养层细胞形成了胎盘绒毛的最外层,因此,胎盘绒毛常用于药物或营养物质的摄取和转运体功能研究。例如,研究氨基酸和葡萄糖的摄取,胎盘的葡萄糖和氨基酸转运载体的激素调节,检测p-糖蛋白(p-gp)的表达和活性[15-16,18]。近年来,胎盘绒毛模型常被用来研究胎盘转运体功能的表达[19-20]。合体滋养层细胞与滋养层细胞培养相比,其优势在于转运载体的表达在整个研究过程不易改变,且极性和细胞间的连接与体内更加相似,优于培养滋养层

细胞系或离体的细胞滋养层细胞。胎盘绒毛模型已经成功应用于妊娠早期及足月胎盘的氨基酸的摄取研究,提示该模型可应用于整个妊娠过程中胎盘摄取的相关研究[17]。胎盘绒毛模型可用于物质在合体滋养层摄取的研究,但不能用于跨细胞转运的研究。而且绒毛碎片由多种细胞组成,运用该模型得到的结果不能完全反映滋养层细胞的摄取。模型的制作方法及鉴定质膜囊泡来源于人足月胎盘上从合体滋养层细胞剥脱的表面微绒毛,将脐带、胎膜和蜕膜从胎盘去除,于母体面切取组织,搅动切碎物使微绒毛膜疏松,用两层棉制纱布过滤,滤液通过差速离心、洗涤进一步纯化获得微绒毛备用。通过监测标志性酶的活性来鉴别膜完整性和方向性:以具有活性的标志性酶含量代表顶膜囊泡的特性,如碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶;在洗涤剂存在与否的条件下,通过检测核苷酸焦磷酸酶的活性判断囊泡的方向性或两面性[21]。模型的应用及评价质膜囊泡可以从滋养层的刷状缘膜和基底面分离,可以分别研究其功能,进而研究各自不同的转运蛋白。例如,ushigome等[22]研究p-gp的生理表达功能,证明了使用p-gp抑制剂、维拉帕米、环孢素a、孕激素或c129抗p-gp的单克隆抗体可以抑制胎盘膜囊对地高辛和长春碱的吸收。近年来,胎盘微绒毛膜多被用来研究p-gp的调节转运、阳离子化合物的转运机制、药物与营养物质转运的相互作用,以及病理条件的胎盘上氨基酸转运的差异[23-24]。质膜囊泡制备是另一种研究胎盘转运的可行的体外模型,这一模型对于研究药物或化学物质透过质膜的转运机制是很有意义的,但是其主要缺点是膜转运蛋白活性的研究需要在不存在调节因子的条件下完成,因此不能完全反映在体情况[25]。

结语

综上所述,人类胎盘灌流模型作为唯一完全保留胎盘结构的模型,是研究药物胎盘转运最有价值的模型。bewo细胞系也是研究药物和营养物质跨滋养层细胞转运最有意义的模型,而且bewo细胞模型与胎盘灌流模型预测的药物转运结果具有一致性[26]。但是这两种方法都有其局限性,人类胎盘灌流模型制备过程比较复杂,并且不能用于研究妊娠早期的药物胎盘转运;bewo细胞模型不能摸拟人胎盘屏障结构在妊娠期呈现的动态变化过程。因此,在实际研究过程中,需要权衡各种方法的利弊,结合多种方法去优化评价药物胎盘转运的模型。近年来,胎盘组织的体外培养由于其独特优势,越来越多地被用来研究药物的胎盘转运。药物胎盘转运应该在今后继续深入研究,并且形成一个规范,运用这些模型阐明胎盘调节药物的分布机制是未来开发妊娠期药物的关键,以确保妊娠期用药对母体和胎儿的安全性。