饲料中牛磺酸含量测定方法

饲料中牛磺酸含量测定方法

牛磺酸（分子式NH2CH2CH2SO2OH，分子量125）是一种氨基磺酸，牛磺酸除了能促进大脑的正常发育外，还能增强机体的免疫力。牛磺酸常用的含量测定方法有：邻苯二醛柱后衍生、2,4-二硝基氟苯柱前衍生、邻苯二醛柱前衍生高效液相色谱法。本文采用2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色谱法测定饲料中牛磺酸的含量。

1.原理：

采用2,4-二硝基氟苯为柱前衍生化试剂与牛磺酸在pH9.0的碳酸氢钠溶液中定量进行化学衍生反应，缩合成二硝基苯氨基酸，在反相色谱柱上进样分离，用紫外检测器进行检测。

2.检测方法

2.1试剂：牛磺酸对照品（中国药品生物制品检定所）、乙腈（色谱纯）、超纯水、2,4-二硝基氟苯（分析纯）、碳酸氢钠（分析纯）、磷酸二氢钾（分析纯）、硫酸锌（分析纯）、磷酸盐缓冲液pH7.0（取磷酸二氢钾6.8g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液291ml，用水稀释至1000ml，即得）。

2.2 仪器：SHIMADZU-10A液相色谱仪（UV检测器）、离心机、超声仪。

2.3色谱条件与系统适用性试验：

色谱柱：Phenomenex C18 Synergi 4u Hydro-RP 80A（150×4.6mm,4um）；

流动相：磷酸盐缓冲液（pH7.0）-乙腈-水（70:20:10）；检测波长：360nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量10ul。理论板数按牛磺酸衍生物峰计算不低于1500，牛磺酸衍生物与2,4-二硝基氟苯乙腈峰的分离度应大于1.5。

2.4溶液的制备

2.4.1对照品溶液的制备：精密称取牛磺酸对照品10mg，加水制成每1ml含0.5mg的溶液，精密量取2ml，按2.4.3方法操作，即得。

2.4.2供试品溶液的制备：精密称取样品约5g于具塞锥形瓶中，精密加入25ml水，超声15分钟溶解，精密加入0.1mol/L盐酸溶液10ml，摇匀，加入15g/L硫酸锌溶液5ml，摇匀，精密加入10ml水，摇匀，4000r/min离心20分钟，取上清液过滤，取续滤液2ml，按2.4.3方法操作，即得。

2.4.3 衍生化反应：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液2ml，分别置于10ml量瓶中，加0.5mol/L的碳酸氢钠溶液（用氢氧化钠溶液调pH至9.0）2.0ml和1%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液1.0ml，混匀，置暗处60℃水浴中加热1小时后取出，冷至室温，加磷酸盐缓冲液pH7.0稀释至刻度，摇匀。用微孔滤膜过滤，精密量取10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。