实验二：细菌涂片的制备和染色镜检1
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普通光学显微镜(light microscope)
普通光学显微镜的分辨率为0.25um。一般细菌都大于 0.25um，故可用普通光学显微镜观察。
显微镜放大法
电子显微镜(electron microscope)
电子显微镜的分辨率为1nm。不仅能看清细菌的外形， 内部超微结构可一览无余。
荚膜
肺炎链球菌Βιβλιοθήκη Baidu膜
1、要用幼龄培养物作革兰染色； 2、涂片不宜太厚，以免脱色不完全造成假阳性
革兰阳性菌：细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致
密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与 碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫 色。
革兰阴性菌：细胞壁肽聚糖层薄，网状结构交联少，类脂含量较
高， 经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加， 结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细菌细胞被脱色，再经石炭
酸复红复染后细胞呈红色。
革兰氏染色法原理：
革兰氏染色法将细菌分为G＋和G- ，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。 用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是 不同的。G＋细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低， 用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫—碘的复合 物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不 同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解， 细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后， 细胞被染上复染剂的颜色。
细菌染色的目的意义：
细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下特别是在油浸 物镜下几乎与背景无反差，很难看清楚，如将其染色，使 折光率增大，便容易观察。由于菌体的性质及各部分对某 些染料的着色性不同，因此可以利用不同的染色方法来区 别不同的细菌及其结构。
染色剂分类：
碱性染色剂：（电离后分子带正电荷）；碱性染色剂主要用于 染核和异染颗粒等细胞结构。
肺炎链球菌
球菌(coccus)
链球菌(streptococcus)
球菌(coccus)
葡萄球菌(streptococcus)
球菌(coccus)
四联球菌(tetrad)
球菌(coccus)
八叠球菌(sarcina)
杆菌(bacillus)
不同杆菌的大小、长短、粗细很不一致。
大
中
小
炭疽芽胞杆菌 3-10 μm
透射电镜
扫描电镜
细菌的大小与形态
观察细菌常用光学显微镜，其大小用测 微尺在显微镜下进行测量，以微米(μm) 为单位。不同种类的细菌大小不一，同 一种细菌也因菌龄和环境因素的影响而 有差异。 球菌
细菌按其外形，主要有 杆菌 螺形菌
球菌(coccus)
双球菌(diplococcus)
脑膜炎奈瑟菌
大肠埃希菌 2-3 μm
布鲁菌 0.6-1.5 μm
杆菌(bacillus)
杆菌的形态多样
两端齐平
两端尖细
炭疽芽胞杆菌
白喉棒状杆菌
杆菌(bacillus)
杆菌的形态多样
分枝杆菌
双歧杆菌
螺形菌(spiral bacterium)
弧菌
螺菌
螺杆菌
细菌抗酸性染色
特殊染色法
是对细菌特殊结构进行染色的方法。包 括芽胞染色、荚膜染色、鞭毛染色等。
玻片准备：透明、洁净、无油渍。 抹片：液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。 干燥固定：火焰固定和化学固定的示范。讲解其目的及注意事项。
2、 细菌涂片的制备：讲解并示范涂片、干燥、固定的方法。 3、 细菌常用染色方法：革兰氏染色法
细菌抹片 的制备
革兰氏染色法： 1. 制片：取待检病料或细菌培养物常规抹（涂）片、干燥、 固定。 2. 初染：滴加结晶紫，染色1-2分钟，水洗。 3. 媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟，水洗。 4. 脱色：用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水，将载玻片倾 斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出 的乙醇无紫色时（20—30秒），立即水洗。
革兰氏染色法过程示意图 革兰氏染 色法动画
细菌的单染色
涂片
干燥
固定
镜检
水洗、吸干
染色1~2min
细菌形态与结构检查法
显微镜放大法——细菌形体微小，肉眼不能
直接看到，必须借助显微镜（普通光学显微镜、 电子显微镜）放大后才能观察。
染色法——细菌体小半透明，经染色后才能
观察较清楚。
显微镜放大法
芽胞染色原理：细菌的芽孢壁比营养 体的细胞壁结构复杂而且致密，透性 低，着色和脱色都比营养体细胞困难。
方法：采用碱性染料微加热着染或延长染 色时间，使营养体（菌体）和芽胞都着色 后，再脱去营养体细胞的颜色而保留芽胞 的颜色，再用其他颜色的染液着染营养体 方法，并可在显微镜下区别。
孔雀石绿—沙黄法染色步骤
蒸
馏
水
涂片
接 种 环 自然干燥 固定
孔
雀
石
绿
初染
7min
干燥 镜检
复染 10~30s
沙
黄
复
水洗脱色
染
脱色
20~30s
酸性染色剂：（电离后分子带负电荷）；酸性染色剂主要用于 染细胞质。
复合染色剂：（在电离后分子不带电荷，故也称为中性染色 剂）；复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次 体。
涂片
涂片染色程序： 自然干燥 固定 染色
干燥 镜检
细菌涂片示例：
水
细菌涂（抹）片的制备和革兰氏染色
实验内容： 1、 细菌抹片的制备：
5.复染：用复红液复染约2分钟，水洗。 6. 镜检：用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。
革兰染色步骤
蒸 滴馏水 水
干燥 镜检
接 种 环涂片
自然干燥
固定
石
炭 酸 复
稀 释 的
红
复染 10~30s
95% 酒精
脱色 20~30s
结草 晶酸 紫铵
初染1-2min
媒染 碘 2-3min
液
革兰染色时注意事项：
普通光学显微镜的分辨率为0.25um。一般细菌都大于 0.25um，故可用普通光学显微镜观察。
显微镜放大法
电子显微镜(electron microscope)
电子显微镜的分辨率为1nm。不仅能看清细菌的外形， 内部超微结构可一览无余。
荚膜
肺炎链球菌Βιβλιοθήκη Baidu膜
1、要用幼龄培养物作革兰染色； 2、涂片不宜太厚，以免脱色不完全造成假阳性
革兰阳性菌：细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致
密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与 碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫 色。
革兰阴性菌：细胞壁肽聚糖层薄，网状结构交联少，类脂含量较
高， 经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加， 结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细菌细胞被脱色，再经石炭
酸复红复染后细胞呈红色。
革兰氏染色法原理：
革兰氏染色法将细菌分为G＋和G- ，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。 用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是 不同的。G＋细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低， 用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫—碘的复合 物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不 同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解， 细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后， 细胞被染上复染剂的颜色。
细菌染色的目的意义：
细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下特别是在油浸 物镜下几乎与背景无反差，很难看清楚，如将其染色，使 折光率增大，便容易观察。由于菌体的性质及各部分对某 些染料的着色性不同，因此可以利用不同的染色方法来区 别不同的细菌及其结构。
染色剂分类：
碱性染色剂：（电离后分子带正电荷）；碱性染色剂主要用于 染核和异染颗粒等细胞结构。
肺炎链球菌
球菌(coccus)
链球菌(streptococcus)
球菌(coccus)
葡萄球菌(streptococcus)
球菌(coccus)
四联球菌(tetrad)
球菌(coccus)
八叠球菌(sarcina)
杆菌(bacillus)
不同杆菌的大小、长短、粗细很不一致。
大
中
小
炭疽芽胞杆菌 3-10 μm
透射电镜
扫描电镜
细菌的大小与形态
观察细菌常用光学显微镜，其大小用测 微尺在显微镜下进行测量，以微米(μm) 为单位。不同种类的细菌大小不一，同 一种细菌也因菌龄和环境因素的影响而 有差异。 球菌
细菌按其外形，主要有 杆菌 螺形菌
球菌(coccus)
双球菌(diplococcus)
脑膜炎奈瑟菌
大肠埃希菌 2-3 μm
布鲁菌 0.6-1.5 μm
杆菌(bacillus)
杆菌的形态多样
两端齐平
两端尖细
炭疽芽胞杆菌
白喉棒状杆菌
杆菌(bacillus)
杆菌的形态多样
分枝杆菌
双歧杆菌
螺形菌(spiral bacterium)
弧菌
螺菌
螺杆菌
细菌抗酸性染色
特殊染色法
是对细菌特殊结构进行染色的方法。包 括芽胞染色、荚膜染色、鞭毛染色等。
玻片准备：透明、洁净、无油渍。 抹片：液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。 干燥固定：火焰固定和化学固定的示范。讲解其目的及注意事项。
2、 细菌涂片的制备：讲解并示范涂片、干燥、固定的方法。 3、 细菌常用染色方法：革兰氏染色法
细菌抹片 的制备
革兰氏染色法： 1. 制片：取待检病料或细菌培养物常规抹（涂）片、干燥、 固定。 2. 初染：滴加结晶紫，染色1-2分钟，水洗。 3. 媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟，水洗。 4. 脱色：用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水，将载玻片倾 斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出 的乙醇无紫色时（20—30秒），立即水洗。
革兰氏染色法过程示意图 革兰氏染 色法动画
细菌的单染色
涂片
干燥
固定
镜检
水洗、吸干
染色1~2min
细菌形态与结构检查法
显微镜放大法——细菌形体微小，肉眼不能
直接看到，必须借助显微镜（普通光学显微镜、 电子显微镜）放大后才能观察。
染色法——细菌体小半透明，经染色后才能
观察较清楚。
显微镜放大法
芽胞染色原理：细菌的芽孢壁比营养 体的细胞壁结构复杂而且致密，透性 低，着色和脱色都比营养体细胞困难。
方法：采用碱性染料微加热着染或延长染 色时间，使营养体（菌体）和芽胞都着色 后，再脱去营养体细胞的颜色而保留芽胞 的颜色，再用其他颜色的染液着染营养体 方法，并可在显微镜下区别。
孔雀石绿—沙黄法染色步骤
蒸
馏
水
涂片
接 种 环 自然干燥 固定
孔
雀
石
绿
初染
7min
干燥 镜检
复染 10~30s
沙
黄
复
水洗脱色
染
脱色
20~30s
酸性染色剂：（电离后分子带负电荷）；酸性染色剂主要用于 染细胞质。
复合染色剂：（在电离后分子不带电荷，故也称为中性染色 剂）；复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次 体。
涂片
涂片染色程序： 自然干燥 固定 染色
干燥 镜检
细菌涂片示例：
水
细菌涂（抹）片的制备和革兰氏染色
实验内容： 1、 细菌抹片的制备：
5.复染：用复红液复染约2分钟，水洗。 6. 镜检：用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。
革兰染色步骤
蒸 滴馏水 水
干燥 镜检
接 种 环涂片
自然干燥
固定
石
炭 酸 复
稀 释 的
红
复染 10~30s
95% 酒精
脱色 20~30s
结草 晶酸 紫铵
初染1-2min
媒染 碘 2-3min
液
革兰染色时注意事项：