酶解法制取蛋白

酶解法生产蛋白

1 蛋白原料

动物性蛋白与植物蛋白相比，原料中脂肪含量较高，不仅影响水解反应的进行，而且所得水解液颜色混浊，影响最终分离效果。因此，在酶解前用丙酮、乙醚对原料进行脱脂处理，对水解反应的进行有促进作用。余礼碧等（2000）研究表明，脂肪磷脂去除的越干净，蛋白质反应中心暴露得越充分，利于酶解反应的进行，并且水解终点明显，固液易于分离。

2 预处理

为了提高酶解效率，一般对原料蛋白作变性预处理，主要方法包括：①热处理。在沸水浴中煮10～60min 后，直接酶解加工或离心收集沉淀。Margearet（1997）认为酶解前的热处理只能提高反应的水解度，而对产物的生理活性没有影响。②强酸处理。用适当浓度强酸处理蛋白原料，离心收集沉淀，并用水悬浮洗涤沉淀数次，去掉余酸。李春美等（2005）研究表明，鱼鳞未经酸处理时水解效果很差，经粉碎并用酸处理后，酶解效率大大提高。蛋白质经变性处理后会充分暴露其水解作用的位点，易于酶的水解作用，进而提高水解度。但谭斌等（2005）的试验结果表明，蛋白质在不同变性程度时对水解度影响很大，变性程度过高反而不利于水解。因此需要根据水解时间长短在保证水解液不变质的条件下适当预处理。

3 酶解

3.1 蛋白酶的选择根据蛋白酶的来源，常选用的蛋白酶分为：动物性蛋白酶（胰蛋白酶，胃

蛋白酶等）、植物蛋白酶（木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等）和微生物蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶，黑曲酶等）；根据蛋白酶作用的最适pH 值来分，可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。由于蛋白质水解液中一些苦肽氨基端的暴露而使得水解液带有苦味，因此，一些风味酶也常常被用于产品风味的调节加工中。一般根据蛋白原料的组成、酶的特性，以及实验目的选择合适的蛋白酶。由于不同蛋白酶的特异性不同，而蛋白原料的蛋白较复杂，使用单一的酶难以提高最终的水解度，对蛋白质进行有效的酶解（朱志伟等，2004）。试验中多以水解度，小肽得率以及产品风味为指标对蛋白酶进行比较筛选或选用复合酶进行水解。

3.2 水解方式研究报道，把酶解与膜分离技术结合在一起，形成连续式水解工艺，对酶的利用率高，产品质量稳定（Chang-Kee 等，2000；Javier等，2000；Juan等，2000）。邹超等（2002）设计了酶解反应+双膜分离的方法酶解酪蛋白，不仅提高了水的利用率，而且有利于产品的分离纯化。朱少娟等（2005）报道，利用超声波预处理酶解底物，水解效率能得到显著提高。

3.3 最适水解条件的研究水解过程中的反应pH、反应时间、反应温度和酶- 底物浓度比是酶

解工艺的重要参数。酶对pH 值的变化非常敏感，一般将初始pH 值固定在所选酶的最适pH 值范围内。随反应的进行，反应液p H 值会有变化，一般采用加碱或配制缓冲液的方法以恒定溶液pH 值。林伟峰等（2005）认为，加碱恒定反应体系pH值将会导致水解产物中盐分含量增加，而不利于降低产品成本和提高产品纯度，并且保持pH 值恒定只对水解度和总氮得率有利，而对肽得率影响不大。在所选酶的最适温度范围内，水解度会随着温度升高而增大，然而当温度超过一定范围时，水解度则会迅速下降。这主要是因为温度过高导致酶迅速失活（龙彪等，2005）。酶加量和底物浓度对水解作用的影响是相对的。有报道认为，加酶量低时，主要为酶控制反应；当加酶量高时，主要为底物控制反应（张琦，2003）。在蛋白酶最适反应条件下，水解度随着水解时间的推移而增大。有报道，蛋白质的酶解程度会影响其水解产物的功能特性Qualia等，1984；Mcnairney 等，1987）。McNairney( 1977)发现过度酶解会损害蛋白质的功能性。这是由水解产生的肽单位的分子大小决定的。随着水解时间的延长，产物逐渐增加，酶的活力会受到抑制，水解速度降低。龙彪等（2005）研究表明，为得到较多的肽含量，水解时间不能过长也不能过短，一般在3～5h内。通过单因素试验确定反应pH、反应时间、反应温度和酶-底物浓度比等4种因素

的取值水平范围后，以水解度和肽得率为检测值，通过正交试验设计、均匀设计以及响应面法分析等多种数学统计的试验设计方法可确定蛋白酶的最佳水解工艺条件。

4 灭酶

一般采用100℃水浴5min 或85℃水浴10min灭酶，以及时中止反应，避免过度水解，也可采用调节pH 或加入酶抑制剂等方法来中止反应。

5 精制

此过程根据对产品的要求不同，处理过程也不同，一般包括以下步骤：

5.1 澄清处理一般采用离心分离的方法，将酶解液经4000r/min 离心，以除去未被降解的大分子蛋白和其他不溶物，得到清亮的水解液。熊善柏等(2000)比较了不同处理方法对水解液澄清效果的影响，结果表明，添加聚乙烯亚胺或添加聚电解质和Ca2+，能很快澄清水解液，而氮损失率较高；而经3000r/min离心后再用硅藻土过滤，不仅能达到澄清目的，而且氮损失少。

5.2 脱苦蛋白质经酶解后可释放出风味物质，并产生一些苦味，这些苦味成分主要为高疏水性肽类。可采用疏水性吸附、包络或肽链端解酶水解等方法去除苦味(Pedersen，1994) 。其中粉末状活性炭的脱苦效果较好，但蛋白氮损失较大。余杰等（2001）采用活性炭和β - 环糊精对鱼蛋白进行联合脱苦的方法，可以降低活性炭用量与蛋白氮的损失。

5.3 脱盐采用H+ 型阳离子交换树脂洗脱蛋白质水解液中的Na+,再经OH-型阴离子交换树脂洗脱阴离子以脱盐。测定发现水解液高速流过阴阳离子交换树脂时，脱盐率较高（张琦，2003）。

5.4 杀菌、浓缩精制后的肽溶液在135℃条件下超高温瞬间杀菌，经超滤、减压浓缩或真空浓缩等方法来提高有效成分的浓度。

例如：鲜海参一70℃速冻一剪切机切片一胶体磨研磨胶体化一加人蛋白酶水解一煮沸灭酶一加入95％的乙醇至体系达60％乙醇度—静止12h一离心一沉淀(海参粗多糖)一上清嘲海参多肽混合物)粗多糖一5％的水溶液一离心取上清液一双氧水氧化脱色-+乙酸钾法除蛋白一冷藏过夜一离。收集沉淀一洗涤一精多糖海参多肽的混合物一超滤法纯化一脱苦脱色一冷冻干燥一海参多肤粉末