科研思路和方法作业
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科研思路和方法作业
(一)研究内容、研究目标、以及拟解决的关键问题
1.研究内容
课题以VZV免疫逃避机制中发挥着重要作用的感染病毒细胞免疫识别的MHCⅠ/Ⅱ类基因抑制为切入点,围绕IFN-γ和参与免疫逃避的的两条主要途径,有目的地观察IFN-γ和相关基因CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ的表达量、分布及变化规律,进一步检测C ⅡTamRNA、MHCⅠmRNA 、MHCⅡmRNA的表达变化以及外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性的动态变化,并对上述指标的相关性及变化规律进行分析,说明调节VZV病毒感染的免疫逃避机制是针灸治疗带状疱疹、减轻疼痛和后遗症的关键。
且明确针刺与放血作用机制的差异所在。
主要开展以下工作:
研究内容:
(1)皮损组织病理学观察。
(2)镜检:外周血有核细胞计数、白细胞、淋巴细胞分类计数、巨噬细胞吞噬功能。
(3)流式细胞仪检测:外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性。
(4)免疫组化法ABC染色法检测:皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHC Ⅰ、MHCⅡ、蛋白的表达及分布规律。
(5)western blot检测:皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ蛋白量的表达。
(6)RT-PCR法检测:皮损组织CⅡTamRNA、MHCⅠmRNA 、MHCⅡmRNA。
2.研究目标:
2.2.1旨在明确针灸治疗带状疱疹,减轻疼痛和后遗神经痛,与调节MHCⅠ/Ⅱ类相关基因、蛋白的分布及表达关系,为针灸治疗免疫逃避类疾病提供科学依据。
2.2.2通过比较针灸与传统抗病毒药物的作用差异,为解决带状疱疹病毒耐药性问题提供
理论依据。
2.2.3旨在明确针刺与放血在治疗疱疹作用机制中的差异。
3.拟解决的关键性问题:
针刺放血对MHCⅠ/Ⅱ类相关基因、蛋白的调节与其有效干预VZV病毒免疫逃避机制的
关系。
(二)拟采用的方案及可行性分析
1.拟采用的方案
实验环境:实验室相对封闭,自然采光,环境温度控制在20℃~25℃之间,湿度控制在60%左右。
实验动物:清洁级昆明种小鼠,体重22~24g,笼养,自由饮食,由上海市实验动物中
心提供全价动物颗粒饲料。
1.1分组及造模:
第一次实验采用大鼠192只,按照体重分层随机,分为6组,每组8只,在造模完成后
开始治疗,连续7天,隔日(第1、3、5、7天)处死一批,动态观察针刺放血对大鼠VZV
病毒初感染的影响;第二次实验在造模后30天开始治疗,观察针刺放血对大鼠VZV病毒潜伏、复发的影响,其他处理同上,第7天处死取材观察;
造模:腹腔注射VZV8805株系病毒,按照100TCID50/0.1ml病毒量接种细胞,感染后
48小时,模型即成。
模型组:造模方法同上,每天陪同正常组、针刺组、放血组、针刺放血组固定,连续7天。
药物组:造模方法同上。
左侧腹腔注射ACV0.1g/kg/d,连续三天,每天陪同正常组、针
刺组、放血组、针刺放血组固定,连续7天。
针刺组:造模方法同上。
按照造模时间的先后顺序,在造模完成后,开始针刺,进针
0.2~0.3mm,平补平泻,留针10min,每日1次,连续7天。
放血组:造模方法同上。
按照造模时间的先后顺序,使用皮肤针沿皮损和脊神经叩刺,
连续7天。
针刺加放血组:方法同针刺组和放血组,治疗连续7天。
正常组:腹腔注射同体积生理盐水。
每天陪同模型组、针刺组、艾灸组固定,连续7天。
1.2 取材方法:
造模结束后,在模型组40只中随机处死8只,取材检测VZV对对小鼠相关指标的影响。
针刺组、放血组、针刺加放血组、药物组、正常组在治疗后的第1、3、5、7天随机处死8只小鼠取材。
取材放入-80o C低温冰箱保存、备检。
1.3穴位选取:
固定小鼠方法:根据小鼠的形体,在木板上钉上四个适当距离的铁钉,将夹子套在铁钉上,用夹子夹住小鼠的四肢以做固定。
小鼠穴位定位参考《实验针灸学》,模拟小鼠的定位
方法:“大椎”在第七颈椎与第一胸椎间;“膈俞”在第七胸椎下两旁肋间,左右侧各一穴;
“合谷”在在手背,当第二掌骨桡侧的中点处,“曲池”在在肘横纹外侧端,当尺泽与肱骨
外上髁连线中点,“委中”在在腘横纹中点,当股二头肌腱与半腱肌腱的中间,“尺泽”在在
肘横纹中,肱二头肌腱桡侧凹陷处。
1.4 观察指标及方法:
1.4.1皮肤组织病理切片
1.4.2镜检:外周血有核细胞计数、白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞分类计数
各组小鼠每天定时,专人割尾静脉采血10μl,加入0.38ml的白细胞稀释液中,摇匀,
静置3分钟,光镜查外周血有核细胞、白细胞数和淋巴细胞、巨噬细胞分类计数;
1.4.3流式细胞仪检测:外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性。
①制备样品:处死动物,离心,收集细胞悬液,滴加特异性免疫荧光抗体,用流式细胞
仪上机检测并进行分选。
②流式细胞仪检测:将分选细胞清洗、离心(1500RPM,10min),清洗两次,弃上清;加
入PI荧光标记抗体;用流氏细胞仪分别检测CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞活性。
③分析方法:测出的数据经PHOENIX公司分析软件Multicycle处理,得出细胞各周期
的CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群、NK细胞相对含量和百分数,并绘出DNA分布的直方图。
1.4.4免疫组化法ABC染色法检测:皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ、蛋白的表达及分布规律。
①制备样品:处死动物,取股骨骨髓,10%福尔马林固定标本,石蜡包埋,4μm厚
切片。
②免疫组化染色检测方法:鼠抗人IFN-γ单克隆抗体(DO-27)(武汉博士德生物有限责
任公司,浓度1:50);鼠抗人 cyclinD1单克隆抗体(DCS/6)(NeoMarker福州迈新公司,
浓度1:100);鼠抗人单克隆抗体CⅡTa 、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ(晶美公司);S-P 免疫组化试剂盒(北京中山公司)。
ABC法:用0.1 mol/L PBST洗,切片与0.1mol/L
PBST(含0.5%H2O2)作用30 min,用0.1mol/L PBST洗,10 min×3次,与一抗4℃温育,用
0.1 mol/L PBST洗,10 min×3次,与二抗(1:1000稀释)室温作用2 h,用0.1 mol/L PBST洗,
10 min×3次,与ABC(1:2000稀释)室温作用1 h.用0.1mol/L PBST洗,10 min×3次.在DAB
溶液中反应,用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液终止反应,用包被有明胶的玻片固定、水洗,用
系列浓度乙醇(70%1次,80%1次,90%2次,95%2次,100%3次,每次5 min)脱水,二甲苯中透明,封边。
③分析方法:IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHCⅡ免疫组化阳性
信号均为棕黄色细颗粒状,染色结果按阳性细胞百分比及染色强度综合记分作半定量分析。
1.4.5 western blot检测:皮损组织IFN-γ、CⅡTa、Stat1α、Jak1、Jak2、MHCⅠ、MHC
Ⅱ蛋白量的表达。
①制备样品:取样品1×106~1×107细胞,PBS清洗,去PBS加0.1~1ml总蛋白抽提试
剂抽提总蛋白;使用KCTMBCA蛋白质定量试剂盒,测定样品浓度。
②方法:变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE);蛋白质转移到硝酸纤维膜,
30mA恒流,4°C转移,过夜;膜在5%BSA溶液中室温孵育1小时,加入一级抗体室温孵育
1.5小时;加入HRP标记的二级抗体,室温孵育1小时;化学发光法检测,X胶片曝光显影。
③分析方法:扫描图片,用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化;将
目的蛋白灰度值除以内参GAPDF的灰度值,校正误差,所得结果代表某样品的目的蛋白相
对含量。
1.4.6 RT-PCR法检测:皮损组织CⅡTamRNA、MHCⅠmRNA 、MHCⅡmRNA。
①提取总RNA:取标本,用试剂(GIB-CO公司,美国)提取总RNA,溶于无RNA酶的
灭菌超纯水中,用紫外分光分度计测定总RNA的浓度和纯度,同时琼脂糖电泳观察其完整性。
将RNA稀释成1mg/L,-80°C保存。
② MHCⅠ、MHCⅡ和β-actin引物序列
CⅡTa: 5′-ACTCGATATCATTCCGGCAGACCTGAAGCAT-3′
5′-GCTCACTGCC-CCAGCCCAATA-3′
MHCⅠ: 5’- TGTCCCGGCCCGGCCTCGGG-3’
5’-TCTCAGCAGGGTAGAAGCTA- 3’
MHCⅡ: 5’-ACCAACGGGACGAGCGCAT-3’
5’-CAAGCCGCCGCAGGGAGGTG-3’
β-actin: 5’- AACGGCTCCGGCATGTGCAA - 3’
5’-CTTCTGACCCATGCCCACCA-3’
PCR反应体系30μl,转录产物3μl,2U Taq DNA聚合酶,10mmol/L 4×dNTP 2μlPOLβ
和β-actin引物。
反应条件:94°C预变性;94°C 50s,55°C 55s,72°C 60s,72°C 10min共30个循环。
③分析方法:产物经SYNGENE凝胶成像系统分析,以目的基因和β-actin积分灰度值的比值,作为目的基因mRNA的相对表达量。
研究路线
3.可行性分析:
1、本人针灸专业硕士、中医外科皮肤病方向在读博士,多学科背景保证实验研究按计划
进展并不断推向深入。
2、前期大量的临床实践和文献回顾性研究显示出针刺放血可改善VZV感染机体免疫功能;
3、研究思路清晰,目的明确,有成熟的理论指导,所选指标针对性强,研究方案可行,
研究方法及技术路线成熟;
4、实验室的软件、硬件设备完全具备科研条件。
上海中医药大学实验室条件先进,课题
所需仪器设备均已具有,所需试剂、抗体均可购买。
5、课题组成员层次结构、知识结构合理,有较强的科研能力和团结协作精神。
4.本项目的特色与创新之处
1、首次开展针灸对VZV免疫逃避机制的研究,进一步揭示针灸改善调节VZV感染机
体免疫功能的的分子生物学机制,也为针灸治疗病毒感染的相关疾病提供了理论依据。
2、通过研究针灸对带状疱疹后遗神经痛的调节机制,促进临床药物、针刺放血等多种
疗法相结合,提高临床疗效,更具实际意义。
3、首次探讨针刺与放血疗法在改善VZV感染机体免疫功能中的差异,为两种疗法治疗
不同病理的相关疾病提供实验依据。
5.年度研究计划及预期研究结果
2008.01-2008.06 建立动物模型,进行细胞分选及各项检测的预实验。
2008.07-2009.07 扩大样本数量,应用流式细胞仪、免疫组织化学方法、Western Blot法、RT-PCR法等方法,完成所有实验。
2010.08-2010.12 完成统计学处理,进行课题总结。
6.预期研究结果
本课题通过观察针刺放血对MHCⅠ/Ⅱ类相关酶类和蛋白的影响,从而揭示针灸对抗病毒、提高免疫力作用新的分子生物学机制,为针灸在皮肤病及相关免疫类疾病中的应用提供
可靠的实验室依据,丰富针灸的科学内涵。
其研究成果不仅为免疫逃避类相关疾病提供新的
治疗思路和方法,同时推动了针灸学与皮肤病学学科的交叉研究,同时明确针刺与放血作用
机制的差异,为针灸在该领域的应用打下基础。
(二)研究基础与工作条件
1. 文献掌握情况:对近20年来国内外有关带状疱疹的相关文献进行了回顾性分析,尤其是
近10年的有关中、西医治疗带状疱疹的临床和实验研究的论文,较全面的掌握了本研究领
域的最新科研动态。
2. 预研究情况:拟开展相关预研究,为下一步的研究提供基础数据。
3. 现有技术力量:本课题的指导老师(硕博导师)和相关成员涵盖针灸、中医外科相关专业,分别主持参与过多项课题,具有较强的科研能力。
4.个人简介:针灸专业本科、硕士,中医外科皮肤病专业博士生,曾参加国家自然基金重大
研究计划1项,国家中管局、省科委、省自然基金项目、省科技攻关计划4项,主持校级课
题1项,参与1项,具备一定的专业技能和科研能力。
(四)经费使用清单
预算支出科目金额(万元)计算根据及理由
合计21均按市场价计算
科研业务费1文献资料的检索、复印、总结、统计
实验材料费19.5药物、抗体、试剂、引物等
协作费0.5估算
实验室改装费。