植物表达载体转化农杆菌操作步骤
植物表达载体转化农杆菌操作步骤
植物表达载体转化农杆菌操作步骤来源：郭庆水的日志植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。
农杆菌转化法详细过程
农杆菌转化法详细过程
一、质粒的构建
1、结合胞外表达载体DNA片段：根据需要，挑选合适的质粒载体，通常是常用的pUC18或pUC19，然后从受体DNA片段中提取事先选择好的促进脱附酶及其他酶结合位；
2、PCR扩增：使用上述质粒模板进行PCR扩增，以获得清洁的受体片段；
3、克隆：把扩增片段和质粒模板克隆到同一质粒中，然后克隆到载体存储库中，以创建定向载体用于后续研究。
二、原核转化
1、准备转化粒菌：在装满氯化物的快速离心管中，将转化菌株(一般为质粒转录系) 用冰凉的悬浮液制成2X数量的悬淋液；
2、增加plasmid 质粒：在用有抗生素控制的细菌方法中，增加转换用材料，如plasmid质粒，磷酸二钙和CaC1₂，以及可能的其他试剂；
3、原核转化：将上述的悬浮液（AP出水液）添加到悬淋液中，然后加入CaC1₂和磷酸二钙，用低频超声处理混合液使其充分作用10分钟；
4、选择转化的细胞：将处理过的转化液投入加有抗生素的培养基中，然后将这些细胞培养到辅助抗生素中，以选择转化的细胞，在抗生素抑制剂中，该细胞会死亡；
5、筛选和鉴定：原核基因转换后，体外状态选择一般会获得若干转换抗性的菌株，最终进行PCR、测序或其他方法以鉴定突变体，以确定该菌株具有最终突变基因。
农杆菌转化流程
农杆菌转化流程农杆菌转化流程一、农杆菌转化前准备1、必需用到的实验资料（1）转录质子DNA：需要准备好转录质子DNA，一般是由特定的宿主表达稳定贮存的转录质子DNA，或从基因构建中可以获得。
（2）农杆菌载体：以合成DNA或者从宿主菌株中获得的农杆菌载体，其中可以放置表达构建，并且有足够的特殊的鉴定序列（如PCR、Restriction digest），可以鉴定它在农杆菌中的位置。
（3）其它实验质子：比如抗性菌株、生物毒素、和其它的必需的分子质子，也可以从宿主中获得。
2、建立农杆菌转化流程（1）根据转录质子DNA、农杆菌载体和实验质子的特性，建立转化流程，确定各项步骤的操作条件。
（2）根据实验室的条件，准备好相应于上述农杆菌转化流程的实验室基础设施，如冰箱、催化器及其他必须用到的实验用品。
3、准备农杆菌显微镜试剂准备好能够激活农杆菌的显微镜试剂，比如，酶共沉淀染色液，用于检测农杆菌的运动能力； UV诱导染色液，用于分析表达的转录质子pDNA在农杆菌中的分布情况；以及抗性染色液，用于分析表达的转录质子pDNA是否具有抗性。
二、农杆菌转化操作1、消毒操作消毒操作是农杆菌转化最重要的一步，需要准备好消毒设备，以及配备灭菌盘、戴手套等安全措施，严格按照安全操作步骤，进行消毒操作。
2、培养基及农杆菌培养将农杆菌放入合适的培养基中，细菌以合适的温度培养，直到细菌数量达到目标为止。
3、农杆菌转化根据预先设计好的步骤，进行农杆菌转化操作，以及对转录质子DNA、农杆菌载体和实验质子的配比等操作，最终完成农杆菌转化操作。
4、农杆菌筛选将转化后的农杆菌通过显微镜试剂以及其他实验方法进行筛选，确定转化的成功率和转录质子DNA的表达水平。
5、农杆菌转化文库构建将转化成功的农杆菌进行分离，收集多个样本进行文库构建，用于后期实验，或者进行其它实验。
农杆菌转化法操作流程
农杆菌转化法操作流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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农杆菌转化法原理
农杆菌转化法原理农杆菌转化法是一种常用的植物基因转化技术，它利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因导入植物细胞内，从而实现对植物基因的改造。
这一技术在农业、园艺和生物学研究领域有着广泛的应用，其原理和操作流程值得我们深入了解和掌握。
农杆菌转化法的原理主要包括以下几个步骤，识别、转移DNA、整合DNA和表达DNA。
首先，农杆菌通过感知植物产生的信号物质识别寄主细胞，然后将其T-DNA（转移DNA）片段转移到植物细胞内。
T-DNA片段携带了外源基因和一些调控基因，一旦被转移到植物细胞内，这些基因就会被整合到植物基因组中。
最后，这些外源基因就会在植物细胞内表达，从而产生相应的表型变化。
在实际操作中，农杆菌转化法需要进行一系列的步骤。
首先，要选择适合的农杆菌菌株，并将目标基因插入到适当的植物转化载体中。
然后，将植物组织暴露在含有农杆菌的培养基中，使农杆菌能够侵染到植物细胞内。
接下来，将植物组织转移到含有适当激素和抗生素的培养基中，促使转化的植物细胞再生成整株植物。
最后，对转化后的植物进行筛选和鉴定，确保外源基因的稳定整合和表达。
农杆菌转化法的优点在于其操作简单、适用范围广泛、转化效率高和转化植物种类多样。
同时，它也存在一些局限性，比如对植物种类的依赖性强、转化后植物的表达水平不稳定等。
因此，在实际应用中需要根据具体情况选择合适的转化方法。
总的来说，农杆菌转化法作为一种重要的植物基因转化技术，为我们研究植物基因功能、改良农作物品质和培育新品种提供了重要的手段。
通过深入了解其原理和操作流程，我们可以更好地掌握这一技术，为农业生产和科学研究提供更多可能性。
基因工程操作步骤
4.目的基因的检测与鉴定 在受体细胞中稳定遗传和正 确表达。
一、目的基因的获取
1 目的基因主要是编码蛋白质的基因： 如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相 关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、 与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的 基因、具调控作用的因子等。
合成
热稳定的DNA聚合酶
特点
半保留复制、 边解旋变复制
半保留复制、 全解旋再复制
结果
形成整个DNA分子
大量的DNA片段
随堂闯关 PCR技术扩增过程
a、DNA变性（90℃-95℃）: 双链DNA模板 在热作用下， 氢断键裂，形成____单__链_
b、复性（55℃-60℃）: 系统温度D降N低A ，引物 与DNA模板结合，形成局部__双__链____。
③例: 转基因抗虫棉
2.将目的基因导入动物细胞
①方法: 显微注射法
①程序
目的基因表达载体提纯
显微注射
受精卵
取卵（受精卵） 新性状动物
3.将目的基因导入微生物细胞
①微生物作受体细胞原因:
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
②常用菌: 大肠杆菌
③常用法: Ca2+处理获得感受态细胞
④过程:
Ca2+处理 大肠杆菌
1.2 基因工程的基本操作程序
知识回顾: 基因工程基本操作的四个步骤
有了目的基因, 我们才能赋予
1.目的基因的获取 一种生物以另一种生物的遗 传特性。
使目的基因在受体细胞中稳
2.基因表达载体的构建 定存在, 并可进行遗传、表达 和发挥作用
载体进入受体细胞稳定表达,
3.目的基因导入受体细胞 才能实现一种生物的基因在 另一种生物中的转化。
植物双荧光素酶报告基因实验步骤
植物双荧光素酶报告基因实验步骤植物双荧光素酶报告基因实验是一种常用的遗传工程技术，用于研究植物生长和发育过程中的基因表达。
本文将介绍植物双荧光素酶报告基因实验的步骤，包括实验材料的准备、实验过程和数据分析。
希望通过本文的介绍，读者能够了解植物双荧光素酶报告基因实验的基本原理和操作步骤，从而在实验中取得良好的结果。
实验材料的准备1.植物基因表达载体：选择适合植物的基因表达载体，通常是含有CaMV 35S启动子的质粒载体。
2.双荧光素酶基因：选择适合植物的双荧光素酶基因，通常是含有GFP和RFP标记的基因。
3.植物材料：选择要进行基因表达研究的植物材料，通常是拟南芥或番茄等模式植物。
4.转化试剂：选择合适的转化试剂，例如农杆菌或利用基因枪进行转化。
实验过程1.构建双荧光素酶报告基因表达载体：首先将选择的双荧光素酶基因插入到基因表达载体中，通常采用限制酶切和连接酶切方法进行构建。
2.转化植物细胞：将构建好的基因表达载体转化到植物细胞中，可以采用农杆菌介导的转化方法或利用基因枪进行转化。
3.筛选转化植株：筛选转化后的植株，通常通过抗生素筛选或基因标记筛选的方法确定转化植株。
4.观察基因表达：观察转化植株中双荧光素酶基因的表达情况，通常通过荧光显微镜观察GFP和RFP的荧光表达情况。
5.分析基因表达：对双荧光素酶基因的表达进行定量分析，通过荧光素酶酶活性测定或荧光强度测定等方法进行分析。
数据分析1.统计分析：对实验得到的数据进行统计分析，包括双荧光素酶基因的表达比例、荧光强度等指标进行统计。
2.图表分析：将统计分析的结果用图表的形式进行展示，包括柱状图、折线图等形式，直观地展示基因表达的情况。
3.结果解读：根据统计分析和图表分析的结果，对双荧光素酶基因在植物中的表达情况进行解读，探讨其在植物生长和发育过程中的作用。
通过以上步骤，可以完成植物双荧光素酶报告基因实验，研究植物生长和发育过程中的基因表达情况，为了解植物生物学和遗传学提供重要的实验数据。
农杆菌的转化流程
农杆菌的转化流程方案一1。
农杆菌的培养及感受态的制备①农杆菌菌株划YM平板，26—28℃培养48 h；②挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中，250 r/min，26—28℃悬浮培养12—16 h；③将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃，8000 r/min，离心8 min；④弃上清,加入用100 mM NaCl （4℃预冷)重悬收集的农杆菌;⑤ 4℃,8000 r/min, 离心8 min；⑥弃上清，加入原始菌液1/50体积（800μ l/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成100μ l）的20 mM CaCl2重悬菌体；⑦置液氮中10 s，放入—20℃冰箱中保存备用。
2.农杆菌的转化（冻融法)将感受态农杆菌置于冰上,加入1μg质粒DNA（体积不宜超过10 μ l），充分混匀,冰上放置30 min;②置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中,待其融化;③加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2-4 h;(或直接用1 mlμl,留500 μ l于管中④ 3000 r/min 离心2 min收集菌体,将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板）;⑤重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干，28℃培养48 h；⑥挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中，28℃，250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化;注:EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素。
在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染.以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。
3．转基因烟草体系的建立⑴烟草无菌苗的培养:① 70%乙醇消毒烟草种子30 s后，用无菌水清洗两次，更换NaClO处理25—30min，无菌水清洗四次；②将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、1。
重组质粒导入农杆菌的方法
快速高效的重组质粒导入农杆菌方法
重组质粒导入农杆菌是现代分子生物学实验中常用的技术手段之一。
本文介绍一种快速高效的重组质粒导入农杆菌的方法，以下分步
骤详细介绍：
1.准备质粒与农杆菌
首先需要准备好目标质粒和能够将质粒导入植物细胞的农杆菌，
确保质粒含有所需的基因片段或表达载体及其相关元件，并检查农杆
菌的生长状况。
2.酵母转化法
将目标质粒转化进酵母菌株，通过高效的酵母菌体内同源重组技术，可将目标基因插入到质粒的多个限制性酶切位点。
即所谓的“重
组质粒”获得。
3.质粒扩增
通过细菌的大量培养以及质粒提取纯化，可获得大量的重组质粒。
4.质粒导入农杆菌
将农杆菌暴露在冷冻-热激素法下，在低温处理后进行热冲击，使
细胞膜发生短暂的电穿孔，导入质粒。
可借助各种或自制的电毒梯度
悬浮体系、不同转化条件（不同转化培养时间、细胞密度、转化介质
温度、电压均值、转化电转换率）优化转化过程，从而提高质粒的导入效率。
总之，在完成上述步骤后，可通过筛选、检测、鉴定和鉴别等手段来验证农杆菌的质粒导入效率和植物转化效果。
通过本文介绍的重组质粒导入农杆菌方法，可以有效地实现农杆菌质粒转化和基因工程中的分子设计。
此方法无需使用昂贵的设备和试剂，且操作简单，成本低，导入质量可控，可广泛应用于植物生物学和农业育种领域的基础与应用研究。
质粒转化农杆菌的原理
质粒转化农杆菌的原理一、引言质粒转化是基因工程领域中常用的技术手段之一，它可以将外源基因导入到目标细胞中，实现基因的转移和表达。
农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤中常见的细菌，具有天然的质粒转化能力。
本文将介绍质粒转化农杆菌的原理及其应用。
二、质粒转化农杆菌的原理质粒转化农杆菌的原理主要包括以下几个步骤：1. 农杆菌感应农杆菌需要处于适宜的生长状态，通常在诱导培养基中培养至对数生长期。
然后，通过改变培养条件，如温度、营养物质等，激活农杆菌的质粒转化能力。
2. 质粒选择为了实现质粒转化，需要选择合适的质粒载体。
质粒载体一般包括选择标记基因和目标基因。
选择标记基因可以使转化后的细胞表现出特定的性状，如抗生素抗性；目标基因则是需要转移和表达的外源基因。
3. 质粒传递质粒转化农杆菌的主要机制是通过农杆菌的Ti质粒（TumorInducing plasmid）进行传递。
Ti质粒是一种环状DNA分子，携带有多个转移基因（T-DNA），可以被农杆菌转移至寄主细胞中。
4. T-DNA转移T-DNA转移是质粒转化农杆菌的关键步骤。
农杆菌通过一系列的信号识别和信号传导机制，将T-DNA转移到寄主细胞中。
其中，Vir 蛋白是农杆菌转移到植物细胞中的主要因子，它能够与植物细胞的信号转导途径相互作用，促进T-DNA的传递。
5. T-DNA整合和表达T-DNA在寄主细胞中经过整合和表达，实现外源基因的转移和表达。
一般情况下，T-DNA会整合到寄主细胞的染色体中，并在细胞的生长和分化过程中，以类似于植物基因的方式进行表达。
三、质粒转化农杆菌的应用质粒转化农杆菌技术已经被广泛应用于农业、医学和生物学研究等领域。
1. 农业应用质粒转化农杆菌技术可以用于改良农作物。
通过导入具有抗虫、抗病、耐盐碱等性状的基因，可以提高作物的产量和抗逆性能。
此外，还可以实现植物的品质改良，如改善食品的营养成分和口感。
构建表达载体的实验流程及其注意事项
质粒纯化：
1、PEG纯化
缺点：摇菌液几百毫升，耗时长，步骤繁多 优点：质粒纯度高（不含线状DNA）
浓度大
2、过柱法：
缺点：柱子吸附能力有限，浓度低，纯度差（甚至有RNA） 优点：省时省力
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质粒的电泳
Marker是酶切片段； 质粒是环形的，还会形成超螺旋结构。
30
质粒验证
1、酶切验证
一般将质粒切成2-3个片段，片段大小是否相符？ 如：连接后酶切的载体片段、目标片段大小与连接前相同？
三、人工化学合成
最后的选择。公司会将合成片段连入克隆载体。需测序验证。
12
汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
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基因工程所用的酶
限制性内切酶 从商品目录上得到有关信息
EcoR I
Pst I
GAATTC CTTAAG
CTGCAG GACGTC
验证每步产物，设置对照以检查每一反 应的效率，都是可取的良策。而要对上述问题应对自 如，又必须透彻理解每一步实验流程所涉 及的实验原理。
——第一版前言（p11）
《分子克隆实验指南》 第二版 ，1996，科学出版社
2
汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
质粒提取：碱裂解法
收获细菌：含有质粒的DH5α、TOP10等 LB可富集2-3次，Teriffic可2次。
溶液Ⅰ： Tris-HCl, EDTA, 葡萄糖 溶液Ⅱ： NaOH, SDS
冰上3-5min，时间过长会： 质粒断裂；羟基化影响酶切
溶液Ⅲ：乙酸钾，冰乙酸 迅速颠倒3次混匀后，置于冰上
植物表达载体转化农杆菌
3.2.2.4 植物表达载体转化农杆菌1) 农杆菌感受态细胞的制备a. 从-70℃保存的农杆菌菌株EHA105甘油管中蘸取农杆菌菌液，在无抗的YEP固体培养基上活化两次。
b. 挑取单菌落接种于20 mL无抗的YEP培养液中，28℃，200 r/min遮光过夜振荡培养。
c. 按2~4%的接种量转接于无抗的50 mLYEP培养液中，28℃，200 r/min，振荡培养5~6 h，至OD600为0.5左右。
d. 分装菌液于50 mL离心管中，冰浴30 min.e. 4℃，4,000 r/min离心10 min，收集菌体。
f. 用5 mL预冷的20 mmol/L CaCl2重悬菌体。
g. 4℃，4,000 r/min离心10 min，弃上清。
用预冷的2 mL 20 mmol/L CaCl2和80%的甘油混合物（4：1）重悬菌体。
h. 在冰浴盒中按每管100~120 μL的量分装于1.5 mL离心管中。
i. 用液氮快速冷冻，存放于-70℃冰箱。
2)冻融化转化农杆菌分别取2 μL表达载体质粒加入到装有农杆菌感受态细胞的离心管，冰浴30 min，37℃水浴3~5 min，再冰浴5 min，加入800 ul无抗YEP培养液，28℃振荡培养4~5 h。
4℃，5,000 r/min离心5 min后，倒掉部分上清至剩余菌液约200 μL，涂布于含有Kan和Rif的抗性YEP培养基上，28℃暗培养2 d左右至单菌落出现。
3)转化子的PCR检测以冻融化转化平板上长出的单菌落为模板，用基因特异引物进行PCR菌液检测。
3.2.2.5 农杆菌介导的PHD1基因对玉米愈伤组织的遗传转化3.2.2.5.1 玉米幼胚愈伤组织的诱导选取人工授粉后11~14 d、幼胚大小在1.5~2.0 mm的果穗，去苞叶直至最后一层，75%的酒精表面消毒，在超净工作台上，用手术刀削去籽粒部分胚乳，用镊子挑出幼胚，盾片朝上接种于诱导培养基上，7 d左右及时去芽去根以确保愈伤组织的正常生长。
农杆菌转化的实验报告
一、实验目的1. 掌握农杆菌转化法的基本原理和操作步骤。
2. 将抗虫基因导入植物细胞，观察转化效果。
二、实验原理农杆菌转化法是一种将目的基因导入植物细胞的方法。
该方法利用农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）将目的基因转移到植物细胞中，并整合到植物细胞染色体DNA上，从而实现目的基因的遗传表达。
三、实验材料1. 植物材料：拟南芥种子、生长培养基、诱导培养基、选择培养基。
2. 农杆菌：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。
3. 抗虫基因：Bt基因。
4. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶。
5. 试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、抗生素、CaCl2、DNA标记染料等。
四、实验步骤1. 目的基因克隆（1）设计引物：根据Bt基因序列设计一对引物，用于扩增Bt基因。
（2）PCR扩增：以Bt基因的DNA为模板，进行PCR扩增。
（3）克隆：将PCR产物连接到载体上，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。
2. 农杆菌工程（1）制备感受态农杆菌：将根癌农杆菌接种于LB液体培养基，37℃培养过夜，按1:100的比例接种于新鲜的LB液体培养基，37℃培养3小时，加入IPTG和CaCl2，使农杆菌进入感受态。
（2）目的基因转化：将克隆有Bt基因的载体与感受态农杆菌混合，在冰浴中孵育30分钟，然后将混合液涂布于含有抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。
3. 植物转化（1）种子处理：将拟南芥种子用70%酒精消毒后，用无菌水冲洗干净。
（2）农杆菌感染：将处理好的种子接种于含有农杆菌的培养基上，28℃恒温培养3天。
（3）筛选转化植株：将感染后的种子接种于选择培养基上，筛选出转化植株。
4. 抗虫鉴定（1）PCR检测：提取转化植株的DNA，进行Bt基因的PCR检测。
（2）生物测定：将转化植株与抗虫性差的拟南芥进行抗虫性比较，观察转化植株的抗虫效果。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤植物遗传转化是一种通过改变植物的遗传物质来实现特定目的的技术。
这一技术已经被广泛应用于植物育种、基因工程和农业生产中。
下面我们将介绍植物遗传转化的具体步骤。
一、选择目标植物和目标基因在进行植物遗传转化之前，首先需要确定目标植物和目标基因。
目标植物通常是经济作物或者重要的研究对象，而目标基因则是具有特定功能的基因，如抗病性、耐旱性等。
二、构建载体构建载体是进行植物遗传转化的重要步骤之一。
载体是将目标基因导入植物细胞的媒介，通常由DNA序列构成。
在构建载体时，需要将目标基因插入到适当的表达载体中，并加入其他必要的DNA片段，如启动子、终止子和选择标记基因等。
三、转化载体到植物细胞将构建好的载体导入植物细胞是植物遗传转化的核心步骤。
目前常用的转化方法有农杆菌介导的转化和基因枪法。
农杆菌介导的转化是将构建好的载体转化到农杆菌中，然后利用农杆菌侵染植物组织，将载体导入植物细胞。
基因枪法则是利用高压气体将载体直接“射击”到植物细胞中。
四、筛选转化植株在转化植物细胞后，需要进行筛选以获得含有目标基因的转化植株。
为了区分转化植株和未转化的植株，常常会在载体中加入选择标记基因。
选择标记基因通常会使转化植株对某种抗生素或除草剂具有耐受性，在培养基中添加相应抗生素或除草剂后，只有含有目标基因的转化植株能够生长下去。
五、培养和繁殖转化植株筛选出含有目标基因的转化植株后，需要进行培养和繁殖。
通常会将转化植株移至含有适当营养物质的培养基中进行生长，以获得足够数量的转化植株。
六、鉴定转化植株在培养和繁殖转化植株后，需要对其进行鉴定，确认其是否成功转化。
鉴定方法包括PCR扩增、Southern印迹和Western印迹等。
通过这些方法，可以检测目标基因在转化植株中的存在和表达情况。
七、后续分析和应用一旦确认转化植株成功，就可以进行后续的分子生物学和生理学分析，如基因表达分析、蛋白质功能研究等。
此外，转化植株也可以用于基因工程和农业生产中，如改良作物品质、提高产量等。
农杆菌介导遗传转化原理
农杆菌介导遗传转化原理农杆菌介导遗传转化是一种常用的遗传工程技术，用于将外源基因导入植物细胞中。
它的原理是利用农杆菌与植物之间相互作用的特点，通过构建适当的载体将外源基因导入农杆菌，然后通过农杆菌感染植物的细胞，将外源基因转移到植物细胞内，使其表达。
农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，具有携带可导致植物组织的病变形成的质体。
这种质体称为农杆菌的转座质粒（Ti质粒），其中包含了表达病原蛋白的基因。
在自然界中，农杆菌通过感染植物细胞并将自身质粒中转座基因转移到植物细胞中，从而引起植物组织的异常增生和瘤形成。
1.构建适当的载体：首先需要构建一个适合农杆菌介导遗传转化的载体，该载体通常包含农杆菌的图纸质粒与外源基因。
2. 转座基因的导入：将外源基因转移到农杆菌中，一般利用基因工程技术将外源基因插入到农杆菌的质粒中，通常选用表达农杆菌亲和素（VirA/VirG）基因的质粒。
这些基因能够诱导农杆菌感染植物细胞并转座到植物基因组中。
3. 农杆菌感染植物细胞：利用农杆菌对植物细胞的感染能力，将转座基因导入植物细胞中。
通常使用离体培养的植物组织进行转化，如幼苗的叶片、幼芽、胚轴等。
在转化过程中，植物组织被浸泡在含有农杆菌的培养液中，农杆菌利用其细菌素（VirE/VirF）蛋白，将转座质粒导入植物细胞中。
4.外源基因的整合与表达：经过转化的植物细胞在激素的诱导下会形成植物的癌瘤样结构，其中农杆菌转座质粒中的外源基因将被整合到植物基因组中。
随着癌瘤的生长，外源基因会在植物组织中得到表达。
5.植物再生和筛选：癌瘤样组织可通过激素的去除和调节激素比例来诱导植物再生。
然后通过选择合适的培养基和条件培养植物胚，获得含有外源基因的转基因植株。
农杆菌介导遗传转化技术广泛应用于植物基因工程中，可用于植物基因功能研究、育种改良、生产含有特定蛋白质的转基因植物等。
这种遗传转化技术具有高效性、简便性和广泛适用性的优点，已被应用于多种作物植物的转基因研究和应用实践中。
农杆菌转化法植物的原理
农杆菌转化法植物的原理
农杆菌转化法是一种常用的植物遗传转化技术，其原理基于以下几个步骤：
1. 选择合适的农杆菌: 选择一种农杆菌（通常是土壤中分离的Agrobacterium tumefaciens），它具有天然的能力将特定的DNA片段（称为T-DNA）转移到植物细胞中。
2. 构建转化载体: 利用分子生物学技术构建一个含有目标基因的转化载体。
该载体通常包含一个植物遗传转化所需的起始和终止序列，并且携带了要转移到植物细胞中的目标基因。
3. 农杆菌感染: 将构建好的转化载体导入农杆菌中，并通过培养增殖出大量的含有目标基因的农杆菌。
4. 处理植物材料: 植物材料（例如叶片、茎部等）经过一定的表面消毒处理，以去除外部的细菌和其他微生物。
5. 培养植物材料: 将处理过的植物材料与含有目标基因的农杆菌共同培养。
一般来说，植物材料会被浸泡在含有农杆菌的培养基中，使农杆菌能够感染到植物细胞。
6. 再生植株: 将处理过的植物材料转移到含有适宜激素和营养成分的培养基中，
促进细胞分裂和成长。
随着细胞分裂的进行，一些转化过的细胞将开始表达和遗传转化的目标基因，最终产生转化植株。
7. 筛选转化植株: 通过添加适当的选择标记基因，例如耐草草灯和抗生素抗性基因，可以筛选出确实发生了遗传转化的植物细胞，从而得到包含目标基因的转化植株。
通过农杆菌转化法，可以将目标基因导入植物细胞中，并实现基因的表达和遗传转移，从而实现对植物遗传特征的改变和改良。
植物表达载体转化农杆菌操作步骤
植物表达载体转化农杆菌操作步骤第⼀部分：农杆菌介导转化⽔稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗⽣素，LBA4404:Rif或Str；EHA 105：Rif或Str；GV3103：庆⼤霉素。
如果不加抗⽣素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗⽣素浓度为：50µg/m l。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养⾄OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离⼼管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离⼼30s，弃去上清液；4）沉淀⽤1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离⼼30s，弃去上清液；6）每管⽤100µl 20mMCaCl2悬浮，⽤于转化；制备好的感受态细胞可马上使⽤，也可按每管200ul分装于⽆菌离⼼管中，于4℃保存48⼩时内使⽤，长期贮存时必须在液氮中速冻后转⼀70℃保存。
使⽤时从⼀70℃取出，置冰上融化后使⽤。
4、DNA直接转化农杆菌：1）50µl农杆菌感受态细胞中加⼊质粒DNA 0.1～1µg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放⼊液氮中5min（或1min），然后⽴即放⼊37℃⽔浴锅中⽔浴5min；3）取出离⼼管，加⼊0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗⽣素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗⽣素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2）⼩量提取质粒DNA，加GTE同时加5µL溶菌酶（50µg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。
农杆菌转化法
农杆菌转化法又名农杆菌Boletus介导转化法。
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根农杆菌转化法。
根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti(Tumour including)质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA)，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。
我们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。
本段步骤1、获取目的基因。
用限制酶切割下目的基因。
2、基因表达载体的构建。
将目的基因与载体(大多数选用质粒)用DNA连接酶连接起来。
3、将目的基因导入受体细胞。
将含目的基因的重组质粒导入农杆菌(农杆菌为受体细胞)。
4、目的基因的检测与鉴定。
用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定(这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见第五步) 几种方法进行检验(根据要求选取不同方法)。
5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体进行个体生物学水平鉴定。
整个转基因体系的建立步骤大致可以归纳为:目的载体的构建---载体的农杆菌转化---农杆菌与植株共培养---转化植株的筛选---转化植株的鉴定。
在每一步中都涉及到很多的方法与技术。
目的载体的构建，包括目的基因的克隆，载体的酶切，连接，以及测序分析。
载体的农杆菌转化，目前有很成熟的方法，试验中应注意热激和冷激的时间。
农杆菌与植株的共培养，即为植株转化实验，在溶液中加入促进植株愈伤生长的激素能一定程度提高转化率。
将重组质粒导入农杆菌的方法
将重组质粒导入农杆菌的方法
重组质粒导入农杆菌的方法通常有以下几种步骤：
1. 选择合适的质粒：根据研究需要选择合适的载体质粒，例如pCAMBIA系列质粒。
该质粒含有T-DNA插入位点，能够容纳外源基因和选择标记基因。
2. 提取质粒DNA：从重组质粒制备DNA，可以使用各种DNA提取试剂盒或自制方法进行DNA纯化。
3. 制备农杆菌：培养农杆菌，通常使用Agrobacterium tumefaciens或Agrobacterium rhizogenes，选择需要转化的菌株和培养条件。
4. 细胞密度调整：充分培养菌株，根据要转移的植物种类调整细胞密度。
5. 细胞混悬液制备：将细胞沉淀物悬浮在含有过渡物质（例如辛烷基胺或凯蒂拉酸）的接种液中。
6. 加入质粒DNA：将质粒DNA加入到细胞混悬液中，通过渗透脆化细胞壁，使质粒DNA能够转移到农杆菌细胞内。
7. 培养菌株：调节培养条件，使细胞继续生长并表达外源基因。
8. 选择转化菌株：利用抗生素或草甘膦等筛选选择标记基因，筛选质粒已成功导入的转化菌株。
9. 验证外源基因转化效果：利用PCR、Southern blotting、Western blotting 等技术检测外源基因是否已经顺利导入并表达。
农杆菌转化法过程
农杆菌转化法过程农杆菌转化法是一种常用的基因工程技术，用于将外源基因导入植物细胞中。
下面将详细介绍农杆菌转化法的过程。
我们需要准备一株带有所需外源基因的农杆菌。
这个外源基因可以是来自同一物种的不同个体，也可以是来自不同物种的基因。
通过将外源基因插入到农杆菌的载体中，并利用细菌的复制机制使其扩增，最终得到大量带有外源基因的农杆菌。
接下来，我们需要准备待转化的植物材料。
通常情况下，可以使用植物的离体组织，如叶片、茎段或种子等。
这些组织通常需要经过一定的前处理，如表面消毒和切割等，以提高转化效率。
然后，将农杆菌和植物材料进行共培养。
首先将农杆菌培养物与植物材料接触，使其充分吸附在植物细胞表面。
然后，将植物材料转移到含有适当培养基的培养皿中，并在适当的条件下进行培养。
培养基通常含有一些必需的营养物质和激素，以促进植物细胞的再生和分化。
在培养过程中，农杆菌会通过其特殊的转运系统将外源基因导入植物细胞中。
这个转运系统包括几个关键的基因，它们共同参与了农杆菌转化的过程。
其中最重要的是T-DNA区域，它是农杆菌载体中的一个特殊片段，负责将外源基因导入植物细胞。
当外源基因成功导入植物细胞后，我们需要进行筛选和鉴定。
一种常用的筛选方法是利用选择性培养基，其中含有抗生素或其他毒性物质。
只有带有外源基因的植物细胞才能在这样的培养基上生长，而未转化的细胞则会死亡。
我们需要对转化后的植物进行进一步的分析和验证。
这包括检测外源基因的存在和表达，以及评估转化植株的性状和遗传稳定性等。
这些分析可以通过PCR、南方杂交、蛋白质表达分析等技术手段来完成。
总结起来，农杆菌转化法是一种可靠、高效的基因工程技术，广泛应用于植物遗传改良和基因功能研究等领域。
通过合理设计实验方案和选择适当的材料，可以实现外源基因的稳定导入和表达，为植物的改良和创新提供了有力的工具和手段。
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第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif或Str；EHA 105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/m l。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。
3）质粒酶切或PCR鉴定。
6、三亲交配法：参考一：1）接种含重组质粒的大肠杆菌于含的LB平板，于37℃培养；（pEmu载体：50μg"ml -1AMP；pK载体：50μg"ml -1Kan；pTCK载体：50μg"ml -1Kan）2）接种含动员质粒pRK2013的大肠杆菌于不含抗生素的LB平板上，于37℃培养；3）接种受体农杆菌EHA105/LBA4404于50μg"mL-1 Rif/Str的LB平板上28 ℃培养；4）分别挑取上述平板单菌落，分别于LB液体培养基中震荡培养；5）待三种菌生长到对数期时，各取50μL，混匀，涂布于无抗生素的LB 平板上，28℃培养过夜；6）挑取长出的小块菌，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养24h；（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pT CK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str）7）用接种环将上述培养液划线于含相应抗生素的LB平板，28℃培养至长出单菌落；（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pT CK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str）8）随机挑取若干克隆，于含相应抗生素的LB液体培养基振荡培养；9）小量提取质粒DNA进行PCR鉴定。
10）将阳性单菌落再次划线纯化。
三亲交配法：参考二：1)从保存根癌农杆菌LBA4404的平板上挑取一个单菌落，接种于10m1不含抗生素的LB液体培养基中，28℃, 200rpm培养24h;2)从保存中间载体的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养约8h;3)从保存辅助质粒pRK2013的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃, 250rpm培养约8h;4)分别取以上三种细菌培养物50u1于1.5m1离心管中混匀，取100u!涂布于无抗生素的LB平板上，28℃培养过夜;5)用接种环将长出的菌落转接到含有Kan 50ug/ml,Str 25ug/ml和Rif 25ug/ml的LB平板上，28℃培养过夜;同时各取1, 2, 3步骤中的菌液100u}分别涂布于含有三种抗生素的LB平板上，作为对照。
注意一、农杆菌提取质粒，拷贝数较低，很难用酶切鉴定的方法鉴别。
因此一般用PCR鉴定。
（PCR鉴定时要做好阴性对照。
一般以未带有目的基因的空载体和未经转化的空农杆菌做对照）。
另外，未完善起见，可做回转化：即将农杆菌中提取的质粒电泳和PCR鉴定后，再将其回转到大肠杆菌中，再提取质粒酶切鉴定。
注意二、LBA4404为利福平和链霉素抗性，EHA105为利福平抗性，pRK2013为Kan抗性注意三、1）、利福平，溶于甲醇或氢氧化钠溶解后无菌蒸馏水定容，贮液20mg/ml，-20保存三个月，使用浓度5 0~100L。
2）、利福平(Rif)先用少量无水乙醇溶解，最后用无菌水配成50mg/ml的母液，过滤灭菌。
3）、利福平用甲醇配成浓度为20mg/ml，于－20度保存。
工作浓度50ug/ml4）、链霉素用水融解至浓度为10 mg/ml后于－20度保存。
工作浓度50ug/ml5）、溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以10 ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
抗生素储存液工作浓度浓度(mg/ml) 保存条件严紧型质粒(μg/ml)松弛型质粒(μg/ml)氨苄青霉素 50 (溶于水) -20℃ 20 60羧苄青霉素 50 (溶于水) -20℃ 20 60氯霉素 34 (溶于乙醇) -20℃ 25 170卡那霉素 10 (溶于水) -20℃ 10 50链霉素 10 (溶于水) -20℃ 10 50四环素 5 (溶于乙醇) -20℃ 10 507、水稻胚性愈伤组织的诱导取授粉后10-15d的未成熟水稻种子剥去种皮，于70%酒精浸泡3min（或75％酒精浸泡1min），再于0. 1%升汞中浸泡15min（或再转入20％的次氯酸钠溶液中于摇床振荡灭菌25min），超净工作台中无菌水清洗3-5次，将消毒后种子的幼胚用镊子挤出，接种于诱导培养基上，每个皿约放35粒，28℃暗培养4－5d，切除胚根，继续培养12-15d，待愈伤长大后进行继代培养，每两周继代一次，共继代2-3次；成熟胚去壳，用镊子将有胚的一半切下，经上述方法消毒后，置于诱导培养基上。
28℃暗培养至长出愈伤组织。
选用培养或预培养4天的愈伤组织作为转化材料。
（第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于农杆菌转化）8、根癌农杆菌的培养平板挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 R if/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pTCK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str），28℃摇床过夜，再按1%接种量转接入50mL同样培养基中（含相应抗生素）培养8小时左右至OD600为0.5左右。
4℃，5000rpm离心5min ，收集菌体。
然后用5mL含100 uM AS的AAM液体培养基重新悬浮沉淀，将菌液转入50mL的含100uM AS的AAM液培中，28℃摇床上培养至OD600=0.5。
9、愈伤组织的预培养取生长旺盛的胚性愈伤组织（从继代培养上挑选分散状，颜色鲜黄的2－3mm的胚性愈伤颗粒）转接到预培养培养基，27℃暗培养3－4天。
生长旺盛的愈伤用于农杆菌转化。
10、愈伤组织与根癌农杆菌的共培养取生长旺盛的水稻胚性愈伤组织（预培养4d的水稻幼胚去掉胚芽或继代2-3周后2-3mm的愈伤颗粒转入新鲜培养基中预培养4d），置于灭菌培养皿中，浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液（含100uM AS）中10-15min后将幼胚取出，中间轻缓晃动数次，倒掉菌液，将愈伤于无菌滤纸上，吸除残余的菌液并凉干，随即转移到共培养培养基上，于28℃（或25℃）暗培养2－3天。
11、洗除农杆菌共培养2－3天后，即农杆菌生长至可见愈伤下有少量菌斑时，挑取共培养的愈伤置于无菌三角瓶中，用（含有250mg"L-1羧苄青霉素的）无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中看不到丝状菌体。
最后一次清洗时静止1小时，让黏附于愈伤上的农杆菌充分扩散到水中。
最后，加入含500mg/L的羧苄青霉素的无菌水，静止30－50min，期间振荡几次，倒掉液体，置愈伤于无菌滤纸上凉干，然后转移到筛选培养基上，置25℃培养箱内暗培养。
11、抗性愈伤的筛选将愈伤转移到选择培养基上筛选抗性愈伤，每两周转接1次。
培养4－8周，多数愈伤褐化死亡，有少数瘤状抗性愈伤从干瘪褐化的愈伤表面长出。
挑选这些抗性愈伤继续在选择培养基上暗培养2次，挑选长大后愈伤的一部分转移到分化培养基上。
（并转入筛选培养基N6-S1中，进行选择培养。
两周后挑选出幼胚盾片处新长出的愈伤组织，转到N6-S2筛选培养基上继续筛选2-3代，2周/代）。
（N6 -S1：N6，100mg"L-1G418，250mg"L-1羧苄青霉素）（N6 -S2：N6，50mg"L-1G418，125mg"L-1羧苄青霉素）12、抗性愈伤的分化培养经抗生素筛选长出的抗性愈伤，PCR初步鉴定后，转入分化培养基中继续培养，26℃暗培养1周，然后转入25℃光照培养（12h光照，12h黑暗）。
13、转基因植株的再生及幼苗移栽转移到分化培养基上的愈伤组织，培养2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随之根也长出。
（筛选4周后，选择生长旺盛，色泽淡黄的抗性愈伤组织，转移到分化培养基进行分化出苗，光照24h/d，再生的小苗长至2-3cm左右时）将幼苗转移到含生根培养基的小三角瓶内，每瓶一株，继续光照培养，待苗高7~10cm时，打开瓶盖于温室中炼苗5~7天，待小苗生长健壮后，移出培养瓶，洗净跟上的培养基，移至温室盆栽（铁盘中）。