蛋白质的提取和分离一般分为四步样品处理11

蛋白质的提取和分离一般分为四步样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定
1.样品处理
(1)红细胞的洗涤
①目的去除
②方法离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效
果），然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层的红细胞液体倒入
再加入用的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤
⑤低速离心（低速短时间）
⑥重复4、5步骤次，直至上清液中已没有，表明洗涤干净。

利于后续血红蛋白的分离纯化，
不可洗涤次数过少。

(2)血红蛋白的释放
加到体积，再加40％体积的溶解细胞膜），置于上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白.
(3) 分离血红蛋白溶液将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层
第1层（最上层）甲苯层
第2层（中上层）的沉淀层，色薄层固体
第3层（中下层）的水溶液层，的液体
第4层（最下层）其它杂质的沉淀层
(4)透析
2.凝胶色谱制作
1）凝胶色谱柱的制作
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

②底塞的制作打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。

a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；
b、在橡皮塞顶部切出锅底状的，在0.5ml的头部切下长的一段，插入橡皮塞孔
内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。

c.剪尼龙网小圆片覆盖在上，用的尼龙纱将橡皮塞包好，插到玻璃管一端。

d、色谱柱下端用移液头部做，连接一细的，并用螺旋夹控制尼龙管的，另一
端放入收集的收集器内
③顶塞的制作插入安装了玻璃管的橡皮塞
④组装将上述三者按相应位置组装成一个整体。

⑤安装其他附属结构。

2）凝胶色谱柱填料的处理
（1）凝胶的选择。

（2）方法
配置凝胶悬浮液计算并称取一定量的凝胶浸泡于中充分溶胀后，配成。

（3）凝胶色谱柱的装填方法
①固定将色谱柱处置固定在支架上
②装填将一次性的缓慢倒入内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。

③洗涤平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH
为7.0）充分12小时。

3）样品加入与洗脱
（1）加样前打开下端出口，使柱内凝胶面上的缓慢下降到与平齐，关闭出口（2）加透析样品
①调整缓冲液面与凝胶面平齐
②滴加透析样品用将1ml 的样品加到色谱柱的
③样品渗入凝胶床
④洗脱打开下端，用磷酸缓冲液洗脱
⑤收集待接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每收集一试管连续收集
3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
判断的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。

【探究案】
探究点一. 分离生物大分子的基本思路是什么？
探究点二.蛋白质的分离和提取的原理是什么？
探究点三.高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？
探究点四.人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？。