8原生质体的分离、培养和融合

（二）培养时的密度
初始的原生质体的植板密度对植板率有很大的影响。 原生质体的植板密度影响原生质体与培养基的营养扩散平衡。 植板密度一般为5103 ~1105个/ml。
形成细胞克隆的原生质 体数 植板率 100% 接种的原生质体数
（三）培养基 KM8p能使原生质体的培养密度下降到10个/ml。 KM8p培养基营养丰富。 （四）光照 最初两周暗培养；
第四节 植物原生质体融合
诱导不同来源的原生质体发生原生质体融合，是获得体细胞 杂种的唯一途径
一、体细胞杂种植物
1、科间（融合）杂种 融合产物可以进行细胞分裂，但亲本之一的染色体会选择性 地消失。 2、属间（融合）杂种
前景诱人：马铃薯番茄→产生了开花结实的融合体、但不 育。
3、种间和种内体细胞融合
KH2PO4
KNO3 CaCl2.2H2O
27.2
101.0 1480.0
KI
CuSO4.5H2O （PH5.7）。
0.16
0.025
MgSO4.7H2O
246.0
(Cocking和Peberdy,1974)。
2、漂浮法：
利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液做离心液，将经过镍 网初筛的过滤液置于蔗糖溶液的顶部，在100g下离心10分钟， 离心后，碎屑沉淀，纯净的原生质体将出现在蔗糖溶液和原 生质体冲洗液的界面上。 利用移液管将原生质体吸出，转移到另一个离心管中，用冲 洗液冲洗3次。 离心液的蔗糖浓度为20-21%。 3、梯度离心法
A：6%的聚蔗糖和9%的聚蔗糖（溶于其他盐类和7%山梨醇 中），组成梯度离心液，经150g离心5分钟。细胞残片留于 管底，原生质体上浮。
B：400g5分钟离心，在蔗糖层之上出现纯净的原 生质体层，碎屑在管底。
原生质体悬浮液，
300mmol/L山梨醇+ 100mmol/LCaCl2
140mmol/L蔗糖+ 140mmol/L山梨醇
（一）化学诱导融合的方法和机制 1、硝酸钠融合法
Carlson等（1972）利用这种方法产生了第一个体细胞杂种。
融合的频率低、异核体的频率低、诱导融合的NaNO3浓度对 原生质体有毒害。
2、高钙高pH值法
Keller和Melchers（1973）利用强碱性（pH10.5）的高浓度 钙离子（50mmol/LCaCl2.2H2O）溶液在37℃，处理30分钟 诱导了两个烟草品系叶肉细胞的原生质体发生了融合。 融合容易，但对于有些原生质体体系来说，如此高的pH值也 许是有害的。
分化时补充光照培养（KM8p在强光下对植物有毒）。
（五）温度 随培养物的种类而不同。 与母体植株相似。
四、原生质体的发育和植物再生 1、细胞壁的再生和分裂
培养一旦开始，细胞壁就开始合成，矮牵牛在1-2天内形成细胞壁，然后 开始细胞分裂。 蚕豆培养细胞制备的原生质体，在培养开始20分钟时就开始细胞壁的合 成，在72小时之后，完成细胞壁的合成。
可以容易地获得可育的后代
4、体细胞融合中的不对称杂种 只带有一个亲本的染色体和另一个亲本的部分染色体或基 因的融合后代。 是体细胞融合的主要产物之一
二、融合的方法和技术 原生质体可以自发地发生融合，但融合频率极低，在体细 胞杂交中没有意义。 在体细胞杂交中，通常都是采用物理的和化学的方法人工 诱导产生融合
旺盛生长的悬浮培养细胞：生长素/细胞分裂素，比值高。
高度分化的叶肉细胞：生长素/细胞分裂素，比值低。需要 较高浓度的细胞分裂素，原生质体才可能恢复分裂。 没有普遍适用的培养基
二、原生质体的培养方法
（一）液体培养法 优点：培养方便，利于补充新鲜培养基，利于培养物的转移和分离。
1、液体浅层培养
将原生质体悬浮于液体培养基中，在培养皿或培养瓶中培养，液层厚 度1mm。
③几乎可以从任何组织（只要细胞还没有木质化）分离 出原生质体。
现在为常规方法。
二、酶解法的材料来源
1、叶肉细胞 取材方便，供应及时，细胞排列疏松，易于酶解液的处 理，有叶绿素标记。 温室生长的植物，叶片干净幼嫩，是较好的材料来源。
无菌苗的叶片更具优势。
2、悬浮培养的细胞或愈伤组织
由禾本科的植物叶片获得适于培养的原生质体是相当 困难的，可以利用培养细胞制备原生质体。
靶原生质体（目的原生质体）接种在饲养细胞之上，植板密度可以下降 到10-100个原生质体。
三、影响原生质体培养的因素 （一）原生质体活力测定
1、目测（显微镜镜检） 纯化后原生质体收缩，生活状态的原生质体可以吸水膨胀。 2、FDA（荧光素双醋酸酯） 生活状态的原生质体可以吸收FDA，在脂酶的作用下释放荧光素，在荧 光显微镜下发射荧光。
原生质体在液滴的中央生长。
（二）固体平板培养
优点：原生质体的位置固定不变，为定点跟踪观察原生质体的发育过 程提供了方便。
（三）双层培养 在培养皿的底部为固体培养基，在固体培养基上滴加原 生质体悬浮液。 优点：固体培养基能够不断地补充液体培养基中的营养， 液体培养基不易干枯。
（四）饲养层培养
是一种低密度培养原生质体的培养方法。
刚游离出来的叶肉原生质体
四、原生质体的纯化
酶解后的混合物中将含有完整的原生质体、亚细胞碎屑（叶绿体、 维管成分）、未被消化的细胞等，因而必须将这些杂质除去。
初步筛选：利用50-70µ m孔径的镍丝网过滤混合物，收集 滤出液，做进一步的纯化。 1、沉降法：
将上述滤出液置于离心管中，在70g-100g下离心2-3分钟，原生质体将 沉于管底，细胞碎屑浮于上清液中。 弃上清，冲洗液冲洗，50g下离心3-5分钟。 冲洗液CPW的配方为(mg/L)：
三、原生质体的分离步骤
（一）取材（叶肉细胞） 充分展开的嫩叶。
洗涤、消毒、无菌水冲洗。
对禾本科植物叶片消毒时，使用苄烷铵（Zephiran）（0.1%） - 酒精（10%）溶液漂洗5分钟效果最好。 （二）酶解 原生质体分离的情况在很大程度上取决于所用酶的性质和浓度。
纤维素酶主要分解细胞壁纤维素。
果胶酶（非常好离析酶）主要降解细胞壁间的中胶层。 有些组织在制备原生质体时，可能还会需要半纤维素酶。
增加膜的透性。 以盐类调节培养基的渗透压对原生质体往往是有害的。
2. 酶解 材料→ 撕掉下表皮→ -修剪成2cm见方小块 → 置于6cm 直径培养皿中(下表面朝下0.5g) → 加2ml酶解液→置于 25-27°C下保持3-4小时左右--轻轻震荡—原生质体释出。 3、影响酶活性和酶解效果的因素 纯度：纯化的酶活性可能降低 PH值：4.7-6.0之间 温度：酶活性的最适温度40-50℃，植物所需温度为25-30 ℃ 时间：30分钟-20小时 用量：1g鲜组织用10ml酶解液的效果很好。
有些悬浮培养的细胞，细胞壁难以用目前的酶制剂降 解，可以在培养基中加入生长素、含硫氨基酸、还原剂或 重金属离子培养细胞，有时可以改变细胞壁的组成。 生长素对细胞壁的可塑性和延长是一个重要的影响因 子，含硫氨基酸和还原剂可以影响细胞壁的双硫键，对细 胞壁的降解有利。 经常进行继代培养的细胞、或培养基中蔗糖浓度较低 的悬浮培养细胞，分离原生质体时的得率高，细胞碎片少。
二、植物原生质体是体细胞遗传学研究的重要实验系统
1、去除了细胞壁，使它能容易地摄取外来遗传物质，如DNA， 染色体、病毒、细胞器等，为细胞水平和分子水平的遗传操 作提供了实验系统。 2、植物原生质体可以自发地或被诱导产生细胞融合，为体细 胞杂交提供了实验材料。 3、植物原生质体也具有细胞的全能性，为植物诱变育种提供 了实验材料。 4、利用植物的原生质体可以非常容易地分离各种细胞器，用 于各种遗传操作。 5、研究细胞膜的功能（信息传递、能量转换、物质运输等） 所以，植物原生质体是体细胞遗传学研究的重要实验系统， 正在越来越为研究者所重视。
500mmol/L蔗糖
第三节 植物原生质体培养
一、原生质体的培养基 1、基础培养基：
KM8p（Kao，Michayluk，1975），成分复杂，有机物增加。
高浓度的甘露醇（0.5-0.7 mol/l）和山梨醇。 2、激素： 禾本科植物，2、4-D的效果就很好。 烟草：NAA优于2、4-D和IAA。
第九章 植物原生质体的分离、培养和融合
第一节 一、概念 原生质体就是除去了细胞壁的裸露的球形细胞。
植物细胞与动物细胞不同，在细胞膜外有一层坚硬的 纤维素组成的细胞壁。 由于这层细胞壁的存在，阻碍了细胞融合的发生和遗 传物质的跨膜传递。
概述
原生质体具有一切活细胞的特性，同时具有许多细胞 完整细胞不具备的特点。这些特点和植物细胞全能性结合 起来，使植物原生质体在遗传工程和体细胞遗传学中开辟 了一个理论和应用研究的崭新领域。
优点：融合频率高，异核体频率高，重复性强，毒性低，产 生的融合没有特异性，可以使动物-动物、动物-植物的原生 质体发生融合。
对融合效果的影响因子： PEG浓度：25-30% PEG的分子量：1500-6000
原生质体失去特有的球形外观，视为细胞壁再生的象征。 只有先再生出细胞壁，才能进行正常的细胞分裂。 2、愈伤组织及胚状体的形成
3 分裂的原生质体27天 第一次有丝分裂2 周 移入不含渗透压稳定剂 的培养基 2周之后 愈伤组织 细胞团
3、植株再生
豆科、禾本科植物再生困难。
第二节
1、细胞壁的组成：
植物原生质体的分离
一、原生质体的分离方法
纤维素、半纤维素、果胶质和少量的蛋白。 2、技术关键：
去除细胞壁，又不损伤原生质体。
3、分离方法 A：机械法分离： 利用高渗的糖液，使细胞发生质壁分离，然后利用利刃切 割。 机械分离法的适宜的材料：高度液泡化的细胞（组织）。
机械分离法的限制： ①得到的原生质体有限。
高钙高pH法诱导融合的试验程序 1、将选种的两个亲本的原生质体1:1混合，调整密度为 2.5×105原生质体/ml。 2、在50g下离心3~5分钟，使原生质体沉淀。 3、去上清，加入2ml促融液，其中含50mmol/L甘氨酸-NaOH 缓冲液， 50mmol/LCaCl2.2H2O 以及400mmol/L甘露醇，pH值 10.5。 4、在50g下离心3~5分钟，使原生质体沉淀。
②只限于能够广泛发生质壁分离的组织。
③不能从成熟的和分生细胞分离原生质体。
B：酶解法分离：
1960年，英国的Cocking首先利用纤维素酶制备了番 茄的原生质体，证实了利用酶解法制备大量原生质体的可 能性。 直到1968年在纤维素酶和离析酶投入市场化生产后， 原生质体的研究才成为一个热门领域。
酶解法的优点： ①能够容易地大量地得到原生质Leabharlann Baidu ②条件温和，完整性好，有活力。
酶解液的组成
• 酶的混合液：
纤维素酶（1-2% 浓度）、果胶酶（0.2- 0.5%浓度）等。
• 渗透稳定剂：
促进酶解，保持原生质体的完整性。 甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等， 适宜的浓度为450800 m mol/L。 • 盐类
氯化钙 50 -100m mol/l，磷酸二氢钾(0.7m mol/l)等。
饲养细胞的制备：
利用5103R的X-射线原生质体，这一照射剂量能够抑制细胞的分裂，但 并不破坏细胞的代谢活性。
该原生质体悬浮密度一般为106细胞/ml，照射后应及时冲洗原生质体2-3 次，除去有毒物质。 将上述原生质体植板（接种）在软琼脂培养基上，植板密度为正常原生 质体培养时的植板密度（ 104 ~ 1105个/ml）。 饲养细胞的来源：同种植物或异种植物的悬浮培养细胞或原生质体。
5、把离心管置于37℃水浴中10~30分钟。
6、用清洗介质（600mmol/L甘露醇，50mmol/LCaCl2.2H2O） 置换掉促融液，放置30分钟。 7、用清洗介质洗涤2次。 8、将原生质体悬浮在液体培养基中进行微滴培养。
3、聚乙二醇（PEG）法 是目前原生质体融合的主流技术 聚乙二醇分子式为HOCH2（CH2-O-CH2）nCH2OH，水溶性
2、液体小滴法培养
将原生质体悬浮于液体培养基中，用吸管吸取原生质体的悬浮液，滴 于6cm直径的培养皿中培养，液滴大小在 0.1-0.2ml左右 。
3、微悬滴法培养
将原生质体悬浮于液体培养基中，用微量移液管吸取原生质 体的悬浮液，滴于6cm直径的培养皿的盖上，液滴大小 2050µ l左右，悬滴培养。 为了防止培养基迅速蒸发，可以在培养基的底皿里加液体培 养基保湿。