血红蛋白的提取

2.粗分离
透析
透析袋具有不同的型号，其膜的孔径不同 低于膜孔径大小的分子将被扩散到溶液中
3.凝胶色谱纯化
色谱柱的制作
3.凝胶色谱纯化
色谱柱的填装
G： 代表交联度 75： 代表得水率，即每克凝胶溶胀使吸水7.5g 不同交联度、得水率的葡聚糖凝胶有不同的最佳分离范围
根据色谱柱体积计算凝胶用量
溶胀
装柱
下层红细胞加入5倍体积生理盐水 缓慢搅拌10min
上清液中没有黄色表明红细胞已经洗涤干净
血浆 血细胞
1.样品处理
释放血红蛋白
洗涤红细胞
加蒸馏水至原血液体积
加入40%甲苯
磁力搅拌器充分搅拌
加蒸馏水的目的： 加入40%甲苯的目的：
涨破血红蛋白 溶解细胞膜
1.样品处理
分离血红蛋白
搅拌样品离心
分层
血红蛋白溶液在第三层
1.样品处理 1.洗涤红细胞
2.释放血红蛋白 3.分离血红蛋白
2.粗分离 透析
3.凝胶色谱纯化
按分子量大小分离其他蛋白
4.纯度测定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电Baidu Nhomakorabea检测纯度
1.样品处理
提取红细胞 （每100mL加入3g柠檬酸钠）
短暂离心
洗涤红细胞
目的：去除杂蛋白，利于后续步骤的分离纯化
去除上清
重复洗涤三次
血红蛋白的提取与分离
知识背景1：色谱
请大家回顾必修一
色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其 方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙， 将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油 醚倒入管中。此时，玻璃管的上端立即出现 几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗， 随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动， 并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲 洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别 进行鉴定。色谱法也由此而得名。
用200mM磷酸盐 （PH7.0）洗涤凝胶 12h
注意：填好的色谱柱不能有气泡，如果有气泡必须重装
3.凝胶色谱纯化
纯化
注意：加样时要缓慢，不要破坏凝胶表面
血红蛋白带有颜色，所以收集红色物质即可
https://www.bilibili.com/video/av44668630?from=search&seid=16206064126817879135
知识背景2：电泳
电泳：在电场力的作用下带电粒子在介质中泳动
琼脂糖凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离蛋白质常选用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
影响电泳的泳动速度的主要因素：1.离子的电荷 2.分子量大小
加入SDS
蛋白质带有不同的电荷
所有的蛋白质都带有均一的负电荷
SDS使所有的蛋白质都带上均一的负电荷，此时电泳的迁移率完全取决于蛋白质分子量的大小
4.纯度测定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯度
具体操作与原理略，感兴趣可参考有关分子生物学教材
电泳后对凝胶进行特殊染色，分析条带
色谱是一类可以对物质进行分离的方法，在化学、生物学中有广泛的应用
平面纸色谱（纸层析）
液相色谱：分子排阻色谱（分子排阻层析）
葡聚糖凝胶：分子量小的物质进入网孔后出柱
流动相：缓冲液 固定相：葡聚糖凝胶 随着流动相的流动， 不同分子量大小的物质在色谱柱内的 保留时间不同
分子量大的物质不进入网孔先出柱 分子量小的物质进入网孔后出柱