叶绿体色素的提取分离及理化性质检测实验报告

实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质

系别：机械工程系班级：机械11实验者：潘霖学号：2011010389

同组姓名：肖鹤翀实验日期：2011.10.22

Ⅰ提取与分离

一、实验目的：

1.学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。

2.了解叶绿素的组成、性质和测定叶绿素有助于理解光合作用的本质。

二、实验原理:

叶绿体是进行光合作用的细胞器。叶绿体中的叶绿素a，叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。

薄层层析色谱法是将吸附剂均匀地涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。

植物活性成分的分离常用薄层层析法和柱层析法，其中柱层析适用于大量制备。

本实验采用薄层层析色谱法，其中固定相用硅胶预制板。

三、实验材料与试剂:

1.新鲜的菠菜叶片。

2.体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7:5:1，体积比）。

3.研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸。

四、实验步骤:

（一）色素提取液的制备

1.取新鲜叶片4~5片，洗净，擦干叶表面，去除中脉剪碎，放入研钵中。

2.向研钵中加入少量CaCO3粉末，再加2~3ml体积分数为95%的乙醇，充分研

磨至糊状，再加10~15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤出，

残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，

即制成叶绿体色素提取液。提取液应避光保存，因提取量较大，可用于其

他相关实验（如后面的叶绿素理化性质的验证）。

（二）叶绿体色素的分离

1.取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，

距下边缘1cm处用毛细管划线，保证划线细直。自然风干后划第二次，重

复操作3~4次，确保划的滤液细线颜色足够深，从而保证分离结果更加明

显。

2.取已经加入适量展开剂的层析缸，把硅胶预制板划过滤液细线的一端放

入，使其下端浸入展开剂中，但注意展开剂液面不可没过滤液细线。迅速

改好层析缸盖（减少展开剂中的苯的挥发）。注意观察硅胶预制板上的颜

色变化，不久即可看到各种色素的色带。

3.当各种色素得到较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板上端边缘处时，取

出硅胶预制板迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。

4.测量并记录前沿和各个色素带距离原点的距离。

五、实验结果与分析:

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经过薄层色谱分离后，叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。

色素带自上而下分别为：胡萝卜素，叶绿素a，叶绿素b，叶黄素。

衡量各色素带在薄层中的位置的相对比移值Rf= （斑点中心到原点的距离）/（溶剂前沿至原点的距离）各自到原点的距离：

展开剂前沿：8.50cm

胡萝卜素：8.10cm ，Rf=0.9

叶绿素a：6.70cm ，Rf=0.79

叶绿素b：6.30cm ，Rf=0.74

叶黄素：5.90cm ，Rf=0.69

事实上硅胶预制板上不止出现了四种色素带，但与实验无关，故忽略。

Ⅱ叶绿体色素理化性质的检验

一、实验目的：

验证叶绿体素的理化性质。

二、实验原理：

1.叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成

甲醇和叶绿素醇及叶绿素盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝

卜素分开。

2.叶绿素吸收光子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回基态时

可发射出红光量子，因而产生荧光。

3.叶绿素的化学性质很不稳定，易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，

破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。

4.叶绿素中的镁可以被H+取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜成为铜代叶

绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的

浸渍标本。

三、实验材料与试剂：

1.新鲜菠菜叶片，叶绿素提取与分离实验中制得的叶绿体色素乙醇提取液。

2.10ml移液管，小试管，试管架，水浴锅（60℃和90℃各一个），洗耳球。

3.体积分数为95%的乙醇，苯，醋酸铜粉末，质量分数为5%的稀盐酸，醋酸-醋酸铜

溶液，氢氧化钾-甲醇溶液。

四、实验步骤：

（一）验证光对叶绿素的破坏作用

1.取2支小试管，各加入

2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用体积分数为

95%的乙醇稀释一倍。将其中一支放在直射阳光下，另一只用锡纸包严置

于试管架上，40min后对比观察颜色有何变化。

（二）皂化作用（绿色素与黄色素的分离）

1．取1支小试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，加入1ml氢氧化钾-甲醇溶液，充分摇匀。

2．片刻后，加入3ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1ml左右蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），然后置于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用

滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静

置。

（三）H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用

1．取两支试管，第一支加叶绿体色素提取液5ml，作为对照。第二支试管加叶绿体色素提取液5ml后，再加入质量分数为5%的稀盐酸数滴，摇匀，

观察溶液颜色变化情况。当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，60℃水

浴加热，观察溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。

2．取剪碎的新鲜菠菜叶片几片，放入试管中，加醋酸-醋酸铜溶液，使之没过叶片，90℃水浴加热，随时观察叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。

（四）荧光现象的观察实验

取一支小试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在照射灯的直射光下

照射，观察并比较溶液的透射光与反射光的颜色。

五、实验结果与分析：

（一）光对叶绿素的破坏作用