实验4 叶绿素的提取、理化性质和含量测定

叶绿素→去镁叶绿素→铜代 叶绿素（稳定而不易降解， 常用醋酸铜处理来保存绿色 植物标本）
2.3.3 皂化反应
• 叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被 叶绿醇酯化。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。
• 叶绿素与碱皂化形成的叶绿素盐能溶于水，极性增大。
皂化分层
• 叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶 于稀酒精溶液中，不能进入苯层；
2.3 叶绿素的化学性质
2.3.1 叶绿素的结构 2.3.2 取代反应 2.3.3 皂化反应
2.3.1 叶绿素 的结构
• 叶绿素a与b很 相似，不同之 处仅在于Chla 第二个吡咯环 上的一个甲基 (-CH3)被醛基 (-CHO)所取代 即Chlb。
2.3.2 取代反应
卟啉环中的Mg处于不稳定的状态，可被H+、 Cu2+ 、Zn2+等离子取代。
亲脂的叶绿醇的“尾巴”: 叶醇是由四个异戊二烯单位组
成的双萜，是一个亲脂的脂肪链， 它决定了叶绿素的脂溶性。
2.2 叶绿素的物理性质
2.2.1 吸收光谱 2.2.2 荧光现象 2.2.3 含量测定
2.2.1 叶绿素的吸收光谱
2.2.2 荧光现象
叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。
• 而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中
• 一部分苯分散在水中形成乳胶体，出现一层乳 白色的溶液
• 低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳 化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。
3 材料、试剂与配备
1 材料 菠菜叶片 2 仪器设备
研钵，漏斗，剪刀，试 管，试管夹，容量瓶 (25ml,50ml)，分光光 度计，水浴锅等 3 试剂 95%乙醇，苯，浓盐酸， 36%乙酸， CuSO4， MgCO3，石英砂
透射光下
反射光下
叶绿体吸收光后，激发了捕光色素蛋白复合体（LHC），LHC将其能 量传递到PSII或PSI。其间所吸收的光能有所损失，大约3%-9%的所吸收 的光能被重新发射出来，其波长较长,也即叶绿素荧光 。
叶绿素吸收红光后处于第一单线态，叶绿素分子要从 第一单线态返回基态所发射的光称为荧光。
分子吸收的光能有一部分消耗 于分子内部的振动上，发射的 荧光的波长总是比被吸收光的 波长要长
以样品重为3g为例: = C ×（25×50 / 5）/3 = OD652 / （34.5×3） ×（25×50 / 5）
6 注意事项
① 操作应在弱光下进行 ？ ② 研磨时间尽可能短，以不超过2分钟为宜 ③ 分光光度计的正确使用(更换波长后要调0) ④ 皂化反应最后做
在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易 乳化而出现白絮状物，溶液浑浊，且不分层。 可激烈摇匀，放在30～40℃的水浴中加热，溶 液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。
4.4.1.2 浓酸 • 取3 ml叶绿素溶液，一滴滴缓慢加入浓盐酸，观察并 记录颜色变化。
4.4.2 皂化反应
– 取3 ml叶绿素提取原液，加1 ml 20% NaOH-甲醇溶液， 摇匀， 65℃水浴5 min；
– 取出冷却后，先加3 ml苯，后加3 ml水（沿壁慢慢加入）， 轻轻摇匀，静置观察其分层现象。
3. 过滤到25 ml容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、 研棒及残渣，最后连同残渣一起过滤（ 直至滤 纸和残渣中无绿色为止）最后用乙醇定容至 25ml(后称原液)，摇匀。
4.2 叶绿素的荧光
• 取3 ml叶绿素提取原液，观察其透射光、反射光 下的颜色；
4.3 叶绿素含量的测定
• 取5 ml叶绿素提取原液移入至50 ml容量瓶， 95%乙醇定容(稀释液)
• 2.3.2.1 稀酸 – 去镁 – 铜代
• 2.3.2.2 浓酸 – 去镁 – 水解
2.3.2.1 稀酸 – 叶绿素溶液与稀酸(如:草酸)作用，H+取代Mg后的产物 为褐色的去镁叶绿素；
– 去镁叶绿素与Cu2+ 或Zn2+作用， Cu2+ 等离子取代后 的产物为深绿色的铜代叶绿素等；
2.3.2.2 浓酸 – 叶绿素溶液与浓酸(如:盐酸)作用，除了代换Mg外，可 使去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成褐绿色的去 镁叶绿酸。
2. 实验原理
2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿素 2.2 叶绿素的物理性质
• 吸收光谱 • 荧光现象
2.3 叶绿素的化学性质
• 取代反应 • 皂化反应
2.1 用含水的有机溶 剂提取叶绿素
亲水的卟啉环的“头部”: 镁原子居于卟啉环的中央，带
正电性，与其相联的氮原子则偏向 于带负电性，因而卟啉具有极性， 是亲水的，可以与蛋白质结合。
5 结果记录与数据处理
5.1 实验现象记录与分析
表1 叶绿素的理化性质
荧光现象
颜色变化/分层
原理
取代反应—醋酸 — CuAc —浓HCl
皂化反应—上层 —中层 —下层
5.2 叶绿素含量计算与分析
• 叶绿素浓度: C＝OD652 / 34.5 ( mg/ml )
• 叶绿素的含量（mg / g）=[叶绿素的浓度×提取 液体积×稀释倍数]/样品鲜重
7 思考题
1 提取叶绿素时为何要加入MgCO3？ 2 为何选用652 nm 测叶绿素的含量？ 3 解释皂化反应的分层现象
实验五 硝酸还原酶活性的测定（p124－ 127）
4 实验步骤
4.1 叶绿素的提取 4.2 叶绿素的物理性质
– 透射光颜色 – 反射光颜色 4.3 叶绿素含量的测定 4.4 叶绿素的化学性质 ① 取代反应 ② 皂化反应
4.1 叶绿素的提取
1. 新鲜菠菜叶片，去掉中脉后的样品称重( 约2-3g, 记录样品重量)；
2. 剪碎入研钵中，加少量石英砂和碳酸镁粉及2-3 ml的95%乙醇，研磨匀浆，再加乙醇混匀；
实验中的注意事项： 1、实验的取材 2、操作及观察 3、实验数据的处理 4、实验结wk.baidu.com的分析：分清错误和误差 5、思考题 6、实验报告
实验四 叶绿素的提取、理化性质 和含量测定 （p130－136）
一、叶绿素的提取 二、叶绿素的理化性质 三、叶绿素含量的测定
1. 实验目的
1）掌握叶绿素的提取及其含量测定的方法 2）了解叶绿素的理化性质
2.2.3 含量测定
• 叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663 nm 和 645 nm；
• 叶绿素a、b在652 nm处有相同的比吸收系数（34.5）， 测OD652求出叶绿素a、b总量。
• 故叶绿素浓度 C＝OD652 / 34.5 ( mg/ml )
• 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积× 稀释倍数]/样品鲜重
• 以95%乙醇作为空白对照，测OD652 • 叶绿素浓度: C＝OD652 / 34.5 ( mg/ml )
• 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液 体积×稀释倍数]/样品鲜重
4.4 叶绿素的化学性质
4.4.1 取代反应
4.4.1.1 稀酸： • 取3 ml叶绿素原液，一滴滴加入醋酸(先快后慢)，观察 并记录颜色变化； • 向上述加醋酸后发生颜色变化的溶液中加少量CuAc颗 粒，65℃水浴加热，观察并记录其颜色变化。