核酸提取常见试剂的作用原理

异硫氰酸胍

强用力得蛋白质变性剂,能迅速溶解蛋白质,导致细胞结构破碎,核蛋白由于其二级结构得破坏消失而迅速与核酸分离。胍盐就是破坏蛋白质三维结构得离液剂,在通常使用得蛋白质变性剂中作用最强得就是异硫氰酸胍,它们可以使多数蛋白质转换成一随机得卷曲状态。含有强力得阴离子与阳离子基团,它们可以形成较强得氢键。在还原剂存在得情况下,异硫氰酸胍可以断裂氢键,而去垢剂,如SDS存在得情况下,可以破坏疏水作用、

盐酸胍、尿素

盐酸胍就是一个核酸酶得强抑制剂,它并不就是一种足够强得变性剂,可以允许完整得ＲＮA从富含RＮaｓe得组织中提取出来。

４-8M可断裂氢键,有两种可能机制:1变性蛋白与盐酸胍、尿素优先结合,形成变性蛋白—变性剂复合物,当复合物被除去,从而引起N－D反应平衡向右移动,随着变性剂浓度增加,天然状态得蛋白不断转变为复合物,最终导致蛋白质完全变性;２盐酸胍、尿素对氨基酸得增溶作用,能形成氢键,当浓度高时,能破坏水得氢键结构,结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基得较好溶剂,使蛋白质内部得疏水残基伸展与溶解性加强,盐酸胍、尿素引起得变性往往就是不可逆得、

高浓度尿素使蛋白质变性并抑制Rnase活性

十二烷基肌氨酸钠

使蛋白质解体变性

巯基试剂

1防止蛋白质或酶等(如辅酶Ａ)分子中SH基团氧化成二硫键,2在某些酶反应过程中维持体系得还原环境。DＴT,DDＴE、巯基乙醇应用最广,谷胱甘肽也常应用,由于她就是生物体内得还原剂,同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放、ＤNA提取中,常使用巯基乙醇,维持缓冲液得还原环境,防止多酚类氧化,由于具有一定得毒性,浓度不应高于2%。

巯基乙醇

β-巯基乙醇得主要作用就是破坏ＲNaｓｅ蛋白质中得二硫键(肽与蛋白质分子中得半胱氨酸残基中得键)、

1 还原蛋白质二硫键,使Rna酶变性

２抑制酚类氧化,若氧化,核酸会变成灰黑色,苯酚得氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸二酯键得断裂及导致ＲNA与DＮA得交联

３保护蛋白质得巯基蛋白质提取中需要

巯基乙醇还原二硫键,使RNA酶失活

化学变性剂SＤS、尿素、盐酸胍能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白质变性但不影响肽键与二硫键,不能使蛋白质彻底变性

加上还原剂巯基乙醇或DTＴ,能还原二硫键,使RＮA彻底变性

ＤTT二硫苏糖醇

刺激性气味要小很多,毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇得浓度低7倍时,两者效果相近,但DTT价格略高一些、由于容易被空气氧化,因此DTT得稳定性较差;但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它得使用寿命。由于质子化得硫得亲核性较低,随着pH值得降低,DTＴ得有效还原性也随之降低;DTＴ或含有DＴT得溶液不能进行高压处理。

抑制Rnase活性

TCEP 三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐

半胱氨酸

Trizｏl

苯酚、异硫氰酸胍、8—羟基喹啉、β—巯基乙醇等。TRIzol得主要成分就是苯酚。苯酚得主要作用就是裂解细胞,使细胞中得蛋白,核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质,但不能完全抑制RNＡ酶活性,因此ＴRIzoｌ中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源与外源RNase(RＮA酶)。

0。１％得８－羟基喹啉可以抑制ＲＮａse,与氯仿联合使用可增强抑制作用。

异硫氰酸胍属于解偶剂,就是一类强力得蛋白质变性剂,可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失,导致细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。

β—巯基乙醇得主要作用就是破坏RNaｓｅ蛋白质中得二硫键、

液氮

组织破碎,裂解细胞

ＳDＳ

十二烷基硫酸钠

阴离子去垢剂,高温(55-６5℃)裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,形成SＤS/蛋白质／多糖复合物,释放核酸,提高盐(KAc或NaＡc)浓度并降低温度(冰浴),使ＳＤＳ/蛋白质/复合物转变为溶解度更小得钾盐酸形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全、离心后除去沉淀,上清液中得DNＡ用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀水相中得ＤNA

操作简单,温与,可提取到高分子量得DNA,但产物多糖类杂质较多

阳离子强表面活性剂,通常与蛋白酶K与抗氧化剂、螯合剂一起使用

可破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与ＤNA分离

溶解膜类蛋白

SDS能裂解细胞。使细胞中得蛋白质与核酸之间常借着静电引力或配位键结合,阴离子去污剂能够破坏这种价键,使染色体离析,蛋白变性,释放核酸。

(1)SDS就是一种阴离子表面活性剂,能使蛋白质得氢键与疏水键打开,并结合到蛋白质得疏水部位;ﻫ(2)SDS可引起蛋白质构象改变

(3)SDS就是一种良好得解离剂,可使蛋白质溶解,变性ﻫ(４)形成SDS-蛋白质复合物,并使复合物带负电

质粒方面:在1％得SDS溶液中慢慢加入5 N得NaＣl,您会发现SDＳ在高盐浓度下就是会产生沉淀得。因此高浓度得盐导致了SDS得沉淀、但如果您加入得不就是ＮaCl而就是KCｌ,您会发现沉淀得量要多得多。这其实就是十二烷基硫酸钠(ｓodiｕm dｏdecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(potassｉum dｏdecylsｕlfaｔｅ,ＰDS),而PDS就是水不溶得,因此发生了沉淀。如此瞧来,溶液ＩIＩ加入后得沉淀实际上就是钾离子置换了ＳDS中得纳离子形成了不溶性得PDS,而高浓度得盐,使得沉淀更完全、大家知道SDＳ专门喜欢与蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生得大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,让人高兴得就是大肠杆菌得基因组DNA也一起被共沉淀了。基因组DNA 一旦发生断裂,只要就是50-100 kｂ大小得片断,就没有办法再被PDS共沉淀了

ＣTAＢ

ＣＴＡB:十六烷基三甲基溴乙胺,低温时易沉淀

阳离子去污剂

一种在高盐下能与核酸结合形成可溶、稳定得复合物,低盐浓度下可沉淀得表面活性剂

就是一种阳离子去污剂, 低离子强度(０。1－0.5MＮaCl),沉淀核酸与酸性多聚糖,而蛋白质与中性多聚糖仍留在溶液中。在高离子强度得溶液中(>0.７moｌ／ＬNaCｌ),CTＡＢ与蛋白质与多聚糖形成复合物,只就是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

CTAB可从大量产生黏多糖得植物及某些革兰氏阴性菌制备纯化得DNA,这种去污剂加入调节至高离子强度得细菌与细胞裂解液中(〉0、7M NａCl),经过连续得酚/氯仿抽提,去除ＣTAB/黏多糖/蛋白质复合体,异丙醇/无水乙醇沉淀上清即可将DNA分离出来

CＴＡB还有提高DNＡ互补链复性速率及稳定已形成得DＮA双螺旋得作用

CTAＢ法得主要特点就是用用较广

ＣTAB溶液在低于１５度会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷得植物材料时,必须预热,且离心温度不低于15度

EＤＴA

酶抑制剂,螯合二价金属,抑制金属依赖性得酶

螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制细胞中ＤNａse得活性,该酶可降解DNA

EＤTA就是去垢剂,结合离子用,而它结合得部分离子就是能够诱发或者促进ＲNA酶活性得,比如Ca2＋。EDTＡ就是一种二价离子熬合剂,能熬合Mg2＋与Ca2+等二价阳离子,而多种R ＮA酶得活性就是需要依赖二价阳离子得,所以EＤＴA能通过熬合二价阳离子来抑制RNA酶得活性

碱性条件下才能够溶解,要与NａOH粉末混合后,再加水,然后用NaＯＨ水溶液调节pH、0、０1M,ＤNase酶基本失活、

BＳA

酶抑制剂,使一些降解酶得活性得表面变性

精胺或其她多胺

酶抑制剂,降低核酸酶得影响

氰化物

酶抑制剂,降低重金属氧化酶得影响

PVＰ

减少酚类、醌类、单宁类物质得影响,抗氧化作用,络合多酚与萜类物质,防止多酚类褐变而氧化,去除多糖与色素,色素就是ＰCR强抑制剂,必须去除

样品液氮研磨及提取缓冲液中加入PＶP或PＶPP等能络合多酚与萜类物质,离心或氯仿抽提出去,有效防止多酚氧化成醌类,避免溶液变褐色而具有抗氧化能力

提取液中加入适量得PVP或PVPＰ能提高DＮＡ得纯度,用量根据杂质而定(１—6％),PVＰ同时能去除多糖,因此将ＰVP与巯基乙醇配合使用并调整用量,能有效防止多酚污染

PＶＰ(聚乙烯吡咯烷酮)就是酚得络合物,能与多酚形成一种不溶得络合物质,有效去除多酚,减少DＮA中酚得污染;同时它也能与多糖结合,有效去除多糖。

Tｒiｔon-ｘ100

TｒitoｎＸ1０0之类得去垢剂有苯环结构,所以在280nm有很强得吸收。

蛋白酶Ｋ

蛋白酶K:切割活性较广得丝氨酸蛋白酶,切割脂族与芳香族氨基酸得羧基端肽键,将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使ＤNA分子完整地分离出来。