土壤微生物DNA提取

原理简介：

独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸梅，然后基因组DNA在高速离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗——离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液讲纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

注意事项：

1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13，000 rmp的传统台式离心机，如

Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2.开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。

3.对于革兰氏阳性菌，需要自备lysozyme，或者lysostaphin。

4.结合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮

肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

操作步骤：

1.取0.5—2毫升培养基菌液（最多不超过2*109个细胞），10，000rmp，离心30秒，弃上

清液，收集菌体，尽可能的洗净上清。

2.加入200μl缓冲液RB重悬洗涤细胞，10，000rmp，离心30秒，弃上清后讲细胞震荡

或者吹打重悬于200μl缓冲液RB中。

3.加入200μl结合液CB，；立刻剧烈颠倒轻摇充分混匀，再加入20μl蛋白酶K（20mg/ml）

溶液，充分混匀，70℃放置10分钟。

4.冷却后加入100μl异丙醇，剧烈颠倒轻摇充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

5.讲上一步所得溶液和絮状沉淀都加入到一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）10，

000rmp离心30秒，倒掉收集试管中的废液。

6.加入500μl抑制物去除液IR，12，000rmp离心30秒，弃废液。

7.加入700μl漂洗液WB，12，000rmp离心30秒，弃掉废液。

8.加入500μl漂洗液WB，12，000rmp离心30秒，弃掉废液。

9.将吸附柱AC放回空收集管中，13，000rmp离心2分钟，尽量出去漂洗液，以免漂洗液

中残留乙醇抑制下游反应。

10.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液

EB（洗脱缓冲液事先在65—70℃水浴中预热），室温放置3—5分钟，12，000rmp离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12，000rmp离心1分钟。

11.DNA可以存放在2—8℃，如果要长时间存放，可以放置在—20℃。