克隆及诱导蛋白步骤

1植物RNA提取

使用天根植物RNA快速提取试剂盒提取棉花RNA，详细步骤见说明书。

核酸分析仪分析RNA浓度

1.打开软件ND-1000V3.5.1，选择“Nucleic acid”；

2.擦拭加样处，用DEPC水清洗（1μl）之后点击“OK”;

3.选择“RNA”，擦拭，再加1μl DEPC水作空白，点击“Blank”；

4.擦拭进样口，吸1μl RNA样品，点击“M easure”,记录结果；

5.擦拭，吸取1μl DEPC水清洗进样孔，点击“Blank”，再次进样，重复步骤4.

6.记录结果:A260/A280; A260/A230; ng/μl

A260是核酸最高吸收峰的吸收波长

A280是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长

A230是碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂的吸收波长

A260/A280的比值在1.6~2.0之间，表明没有蛋白质污染

A260/A230的比值在2.0~2.4之间，表明没有盐类小分子污染

剩余RNA放-80°冰箱保存或继续进行试验

2基因克隆

根据转录组及基因组注释的目的基因ORF序列，合并同源基因，设计了引物，以期获得全部家族基因。处理的棉花叶片提取RNA，

反转录天根快速反转录试剂盒合成第一链cDNA

无RNase离心管

1.各试剂使用前混匀并短暂离心；

2. gDNA去除体系，混匀，短暂离心，置于42 3min 后置于冰上。℃TotalRNA 约1500ng

5×Buffer 3μl

RNaseFreeddH2O 补足到15μl

3.反转录反应体系

10×FastRT Buffer 3μl

RTEnyme Mix 4μl

FQ-RT primer Mix 2μl

RNase -Free 7.5μl

Total 15μl

4.取3混合液加到2步溶液中，混匀，并轻微离心；

5.42℃孵育15min，95℃孵育3min 放到冰上。得到cDNA用于后续试验。℃保存。-20．

PCR检测模板l 10μTaqmix

l

μ0.4 ACT-jianceF

l μ0.4ACT-jianceR

l μ 1 T

l μ8.2 ddH2O

l 20μTotal

PCR程序4min 94℃

30s

94℃

30s 38cycles 55℃

72℃30s

10℃∞

做胶，跑胶

若条带在400-500bp之间，说明模板可用克隆，P基因

或做荧光定量检测目的基因表达上调或下调。

（实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

检测方法

1.SYBRGreenⅠ法:

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBR定量PCR扩增荧光曲线图

PCR产物熔解曲线图(单一峰图表明PCR扩增产物的单一性

2.TaqMan探针法:

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。）

做蛋白功能接下一步

高保真酶Pfu

l 5μ5XHFBuffer

l μ 2.5 dNTP

μ0.5 Pfu

l μ0.5 FP

l μ0.5 RP

l μ3 T

l μ13 ddH2O

l 25μTotal

PCR程序4min 94℃

30s

94℃

35cycles 30s ℃

72℃s

10℃∞

电泳，若条带符合序列长度，则进行胶回收。

胶回收

1.在紫外灯下切含目的的基因胶；

2.加500μl Buffer DE-A混合后75℃6~8min至胶熔化；

3.加250μl Buffer DE-B混合(目的片段＜400bp，加1体积异丙醇)变黄色，准备DNA制备管，置于2ml离心管中；

4.吸取3中混合液于DNA制备管中，离心12000r/min，30s，弃滤液；

5.制备管重置2ml离心管，加500μl Buffer W1(除去蛋白质)，离心12000r/min，30s，弃滤液；

6. 加700μl Buffer W2(除去离子、盐)，离心12000r/min，30s，弃滤液，弃废液后以同样的方法再用Buffer W2(除去离子、盐)洗涤一次，离心12000r/min，1min，弃滤液；

(确定在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇，两次

冲洗，使用Buffer W2能确保盐分被完全消除，消除对酶切反应的影响)

7.将制备管置回2ml离心管中，离心12000r/min，空离1min;

8. 将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中加入20μl去离子水ddH2O,室温静置1min，离心12000r/min，1min,洗脱DNA。（将去离子水加热至65℃，提高洗脱效率）

连接

快连连接PEASY- T3(Blunt)．

DNA 4μl

吹打、离心T3载体1μl

，分两管使用）lμ100时拿感受态细胞（每支30min,20min室温连接转化10min; ℃冰箱中取出，置于冰上trans 1-T1 感受态细胞从-801.将μl感受态细胞中；轻轻吸已连载体，打入2.50 冰上静置30min；3. ℃热激45s，勿动；4.42 5min/2min；

5.冰上静置LB液体培养基；

6.在超净台上向已经完成转化的离心管中加入500

μlA－7.37℃200 rpm 1h

涂板）；1.取出已倒好的板（烧好玻璃棒，凉30min 离心管中混匀；40μl IPTG 在1.5ml102.取μlAmp＋、40μlX-gal、分别取3.90μl于板上，涂匀；取400

μl已摇好的菌涂板；4. 先正置培养30min,；再倒置培养12-16h5. ℃保存，以

备后续试验6.4 培养基LB400mL 1L 1L

4g Tryptone蛋白胨（）10g

2g 酵母提取物（Yeast extract）5g

4g 10g NaCl

6g 固体）琼脂粉（Agar powder, 15g(1.3-1.5%)

。蒸馏水定容至1L/400mL枪枪头挑斑，一个枪头一挑斑：加入200μl Amp+ LB 于离心管中，用2.5μl 12h。个斑，打入离心管中，每个板挑12个菌，摇菌点的每个斑之间的与蓝斑相近的斑，（挑白斑中等大小，相对在培养皿中部，距离不要太近）PCR

菌液l 10μTaqmix

0.4 M13F μl

l 0.4μM13R

l

μ1 T