用正交法测定几种因素对酶活力的影响实验报告

用正交法测定几种因素对酶活力的影响

一、前言

正交实验法

正交实验法就是利用排列整齐的表-正交表来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果。正交表能够在因素变化围均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，由于正交表具备均衡分散的特点，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。正交实验设计包括两部分容:第一，是怎样安排实验;第二，是怎样分析实验结果。

酶活力

酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。

二、实验目的

1.学习并掌握正交法应用原理。

2.采用正交法测定多种因素对酶活力的影响。

三、实验原理

酶促反应常常同时受到多种因素(包括激活剂和抑制剂等)的交互影响，可采用正交法进行综合研究，即通过少量试验收到更好的效果：多快好省。本实验以正交法同时测定[S]、[E]、温度和pH值对trypsin 活性的影响，以求得酶活最大时相应影响因素的最佳值(水平)，并借此初步掌握正交法的使用。

四、实验器材和试剂

实验器材：

①试管

②漏斗

③温度计④吸管

⑤恒温水浴锅

⑥分光光度计

实验试剂：

①2%血红蛋白液(Hb)

②15%三氯醋酸液(TCA)

③trypsin酶液④0.04mol/L巴比妥缓冲液(pH 7, 8, 9)

⑤考马斯亮蓝染液

五、实验操作

1.实验设计

本实验为四因素三水平(总试验次数34=81)，可选用L9正交表（仅需9次试验)，展开后其特性为均衡搭配

（1）每列中水平数1、2、3出现次数相同，均为3次；

（2）每两列的横行数对(1-1/1-2/…/3-2/3-3)各出现一次。

2.将各因素及其相应水平参数依次填入得到实验安排表

（1）各试管编号，分别加入对应容量的底物(2% Hb)和相应pH 值的缓冲液，混匀；

（2）同温处理的3支试管同时预温5min；

（3）各试管依序分别加入对应容量的trypsin酶液(统一加样时间间隔)，混匀；

（4）同温处理的3支试管置对应恒温水浴中反应10min；

（5）各试管依次加入15%三氯醋酸液2ml，混匀以终止反应；

（6）非酶促对照：另取一试管，先加入2%血红蛋白液0.5ml

及pH8缓冲液2.0ml，再加15%三氯醋酸液2.0ml，混匀静置10min后再加入酶液0.5ml；

（7）上述各管反应液室温静置15min后过滤，取滤液待测酶活；

（8）酶活测定(考马斯亮蓝法，标准曲线制备略)：取试管若干支编号，分别加入对应的样品滤液1.0ml及考马斯亮蓝液4.0ml，混匀，室温静置3min，以非酶促对照管为空白，于波长595nm比色测定。

3.数据记录及分析

将各管测定所得光密度值对应填入表格，分别算出各因素一、二及三水平的试验结果总和Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，并分别取其平均值计算相应的极差(各列中最大与最小值之差)；比较各因素极差的大小以评估各因素对酶活的影响，并对酶活最高时的各因素水平作一直观分析。

六、实验结果及数据处理

1.实验数据：

50℃0.059

0.0560

0.096

0.0967

0.079

0.0810 0.058 0.097 0.082

0.051 0.097 0.082

60℃0.140

0.1417

0.163

0.1610

0.065

0.0660 0.141 0.159 0.064

0.144 0.161 0.069

2.实验数据处理分析：

列号试验号

1

[S]/ml

2

[E]/ml

3

温度/（℃）

4

pH

试验结果

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0.2

1 0.2

1 0.2

2 0.5

2 0.5

2 0.5

3 0.8

3 0.8

3 0.8

1 0.2

2 0.5

3 0.8

1 0.2

2 0.5

3 0.8

1 0.2

2 0.5

3 0.8

1 37

2 50

3 60

2 50

3 60

1 37

3 60

1 37

2 50

1 7

2 8

3 9

3 9

1 7

2 8

2 8

3 9

1 7

0.0023

0.0560

0.1417

0.0967

0.1610

0.0667

0.0660

0.1840

0.0810

Ⅰ（一水平试验结果总和）Ⅱ（二水平试验结果总和）Ⅲ（三水平试验结果总和）0.2000

0.9247

0.3310

0.1650

0.4010

0.2894

0.2530

0.2337

0.3687

0.2443

0.1887

0.4224

Ⅰ/3 0.0667 0.0550 0.0843 0.0814