江西省汉坦病毒分离及其S和M基因特征分析

江西省汉坦病毒分离及其S和M基因特征分析
刘师文;徐刚;施勇;龚甜;李健雄;刘晓庆;熊英
【摘要】目的对2011年江西省采集的鼠肺标本进行汉坦病毒的分离鉴定,了解分离病毒株的基因特征.方法采用Vero-E6细胞对阳性鼠肺标本进行病毒分离,采用直接免疫荧光法和RT-PCR方法对毒株进行鉴定.扩增分离株的S、M片段基因进行克隆测序.运用DNAstar软件包和MEGA3.1软件对序列进行分析.结果从15份标本分离到2株来自褐家鼠的汉城型汉坦病毒.对其中1株病毒的S、M片段进行了克隆和序列测定,其中S片段含1 772个核苷酸,编码429个氨基酸;M片段含3 651个核苷酸,编码1 133个氨基酸.经核苷酸和氨基酸同源性分析,新分离株与国内外汉城型病毒核苷酸同源性94.8％～98.0％,氨基酸同源性98.2％～99.6％.与汉城型标准株80-39株相比,S片段仅1个氨基酸位点发生变异;M片段有9个氨基酸位点发生变异,糖基化位点的数目和位置没有发生变化.结论从江西省褐家鼠分离到两株汉城型病毒,病毒基因变异较小,型别相对稳定.
【期刊名称】《中国人兽共患病学报》
【年(卷),期】2015(031)012
【总页数】6页(P1157-1161,1199)
【关键词】汉坦病毒;病毒分离;M基因;S基因;序列分析
【作者】刘师文;徐刚;施勇;龚甜;李健雄;刘晓庆;熊英
【作者单位】江西省疾病预防控制中心,南昌 330029;江西省疾病预防控制中心,南昌 330029;江西省疾病预防控制中心,南昌 330029;江西省疾病预防控制中心,南昌
330029;江西省疾病预防控制中心,南昌 330029;江西省疾病预防控制中心,南昌330029;江西省疾病预防控制中心,南昌 330029
【正文语种】中文
Support by the Provincial Health Department of Jiangxi Province (No. 20123156)
汉坦病毒(Hantavirus，HV)属布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantavirus)，是有包膜的负链 RNA 病毒。

HV基因组由大(L)、中(M)、小(S)3个基因片段组成。

目前已经有40多个血清型或者基因型，并且至少有22个型的HV能引起人类疾病[1-2]。

鼠类等啮齿动物是HV的自然储存宿主，人类主要通过吸入受感染动物的分泌物或排泄物而获得病毒感染。

在世界上很多国家，鼠源的HV感染导致的人类肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)或汉坦病毒肺综合症是非常重要的人兽共患病。

中国是HFRS流行最严重的国家之一，发病数和死亡数在全世界最多[3-4]。

目前国内外已分离到很多HV，江西地区早在20世纪80年代就由刘佩琴等人分别从社鼠和罗赛鼠中分离到HV C94株和 L99株[5]。

L99株曾作为疫苗株制备肾综合征出血热地鼠肾灭活疫苗[6]。

之后再未见江西地区分离到HV的报道，关于HV的检测一直停留在免疫检测水平。

本研究对2011年采集的HV阳性鼠肺标本进行病毒分离，并对分离株进行了S和M片段基因测序分析，以了解我省HV的基因特征和遗传变异情况，为HFRS的防控提供科学依据。

1.1 标本来源于2011年春秋季，在江西省高安、安义、新建、上饶、上高和浮梁县(市)捕鼠，共捕获鼠类616只鼠，对鼠肺进行了直接免疫荧光HV抗原检测，从41份HV阳性鼠肺中选取15份保存较好的鼠肺标本进行病毒分离。

1.2 主要试剂和材料Vero-E6细胞来自中国疾病预防控制中心病毒病所出血热室，荧光素标记的汉坦病毒抗体、(第四军医大学)、小牛血清(杭州四季青)、胎牛血清(GIBCO)、MEM(GIBCO)、Rneasy Mini Kit (Qiagen)、SuperScript® Ш First-Strand synthesis system for RT-PCR(Invitrogen)、2 000 bp DNA Marker、Pyrobest® DNA Polymerase(TaKaRa)、聚合酶链反应(PCR)相关试剂(Promega)和细胞刮刀(Corning)。

1.3 病毒分离将HV阳性的鼠肺标本经液氮研磨后用MEM溶液(含1%青霉素和
链霉素，pH7.4)制成10%悬液，3 000 g离心10 min，取1 mL上清接种于
Vero-E6细胞，37 ℃孵育2 h；吸去残留液体加入2%牛血清的维持液，37 ℃培养。

每3～4 d换1次维持液，28 d传代1次。

分别在每代第7、14、21、28 d
用细胞刮刀刮取少量细胞涂片进行直接免疫荧光检测。

连续传代3次仍为HV阴
性者，则放弃培养。

1.4 培养物的直接免疫荧光检测用细胞刮刀刮取少量细胞至载玻片，在生物安全
柜干燥，冷丙酮固定20 min，PBS冲洗2次，蒸馏水漂洗1次，吹干，加荧光素标记汉坦病毒抗体，置湿盒内37 ℃孵育30 min取出， PBS冲洗3次，蒸馏水漂洗1次，吹干，甘油封片后在荧光显微镜下观察结果。

1.5 核酸提取、扩增、克隆和测序对出现免疫荧光阳性结果的培养物，采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit提取，具体步骤参照产品说明书。

引物见表1，逆转录及汉坦病毒鉴定引物和方法参照2004版《全国肾综合征出血热监测方案(试行)》。

采用P14引物及SuperScript® Ш First-Strand synthesis system for RT-PCR试剂盒合成cDNA，反应体系和反应条件参照试剂盒说明书。

S片段采用1对引物，M片段采用2对引物扩增，PCR反应条件：95 ℃ 变性5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min，共扩增40个循环，72 ℃延伸 20 min。

1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，目的片段扩增产物送上海生工生物工程有限公司
进行克隆并测序。

1.6 基因序列分析运用DNAStar 软件(SeqMan)对测定的序列进行拼接，得到S
和M片段基因的核苷酸序列，并推导出相应的氨基酸序列。

选择GenBank公布
的国内外HV代表株基因序列用于比较分析，运用MEGA3.1和DNAstar软件包
进行系统发生分析。

参考毒株信息见表2。

2.1 病毒分离从江西省新建县的褐家鼠中分离到2株HV，命名为JiangxiXinjianRn-07-2011和JiangxiXinjianRn-09-2011。

对培养物进行直接免疫荧光实验，这两份标本均在第1代第21 d开始出现特异性的荧光颗粒，第2代第7 d，所有细胞带特异的荧光颗粒。

而其他培养物培养3代都没有出现特异性荧光颗粒。

2.2 病毒鉴定采用HV特异性引物(HV-MG2F、HV-MG2R)扩增新分离两株病毒，均获得一个445 bp (1 910～2 354 bp) 目的片段。

基于M片段300个核苷酸序
列(2 003～2 302 bp)构建系统发生树见图1。

这2株病毒均分布在汉城型病毒(SEOV)分支并由此得出这两株病毒均为SEOV型HV。

2.3 S和M片段核酸扩增选择JiangxiXinjianRn-09-2011株进行S和M基因片
段扩增(图1)，一条S目的片段大小1.7 kb， M片段分两段扩增，目的片段大小
分别为2.2 kb和1.7 kb，与预期结果相符。

2.4 S和M片段核苷酸序列分析 JiangxiXinjianRn-09-2011病毒株S片段基因序列(GenBank登陆号为KP859512)为1 772 bp，其中 A、T、C、G的比例分别为31.60%、26.41%、18.91%、2
3.08%，A+T含量58.01%，C+G含量为
41.99%。

JiangxiXinjianRn-09-2011的S片段核苷酸与GenBank公布的14株SEOV核苷酸同源性达95.7%～98.0%，与SEOV国际标准株80-39株的同源性
为97%；与WuhanRf02株同源性为98.0%；与GOU3株同源性为88.2%，与
汉滩型(HTNV)、多不拉伐型(DOBV)等其他型别的HV同源性均低于75%。

JiangxiXinjianRn-09-2011病毒株的M片段基因序列(GenBank登陆号为
KP859514)为3 651个核苷酸，其中A、T、C、G的比例分别为30.65%、
30.35%、18.49%、20.51%，A+T含量61.00%，C+G含量为39.00%。

M片段核苷酸与GenBank公布的8株SEOV核苷酸同源性94.8%～96.1%，与朝鲜分
离株DPRK08同源性最高为96.1%，与80-39株同源性为95.5%；与GOU3株
核苷酸同源性为84.6%，与HTNV型同源性为71.1%～71.3%，与其他型别HV
核苷酸同源性均低于70%。

运用MEGA3.1和DNAStar软件，以邻位相连法(Neighbor-Joining)分别构建S
和M片段核苷酸系统发生树(图3和图4)，JiangxiXinjianRn-09-2011株分布在SEOV分支。

图3还显示JiangxiXinjianRn-09-2011与WuhanRf02株亲缘关系最近。

2.5 氨基酸序列分析 JiangxiXinjianRn-09-2011株S基因片段只存在1个开放阅读框(43～1 332 nt)，编码429个氨基酸，5′端和3′末端分别含43个和440个
核苷酸的非编码区。

其编码的氨基酸序列与SEOV氨基酸同源性98.2%～99.8%，国际标准株80-39株同源性为99.8%，仅第186位的氨基酸发生变异，变异率为0.23%；与江西地区分离的疫苗株L99株氨基酸同源性99.3%，氨基酸变化情况
为T43A、S186F、A288S。

与HTNV型76-118株的氨基酸同源性为84.4%，与其他型别HV氨基酸同源性均低于85%。

JiangxiXinjianRn-09-2011株M基因片段只存在1个开放阅读框(47～3 448 nt)，编码1 133个氨基酸，5′端和3′末端分别含46个和203个核苷酸的非编码区。

其编码的氨基酸序列与SEOV同源性98.7%～99.6%，与HTNV 76-118株的同
源性为77.8%，与其他型别HV氨基酸同源性更低。

氨基酸序列分析发现，G1区末端存在保守氨基酸序列642WAASA647，是前体
蛋白的裂解信号。

G1区存在5个潜在的天门冬酰氨糖基化位点，分别为第132、
233、345、397、560位，G2区926位存在1个潜在糖基化位点。

与80-39株、L99株比较，M片段糖基化位点的数目和位置没有发生变化。

G1区含34个半胱
氨酸，G2区含28个半胱氨酸，同80-39株、L99株相比增加了一个半胱氨酸。

与标准株80-39株相比JiangxiXinjianRn-09-2011 M片段氨基酸共有9个氨基
酸位点发生了变化，变异率为0.79%，氨基酸的变化情况详见表3。

病毒分离对病毒性传染病的研究至关重要，获得病毒株就能全面系统的进行研究，且有较好的重复性和可信度，还能为疫苗的研制打下基础。

本研究在2011年对江西省6个县区开展了HV的分子流行病学调查，共采集了616份鼠肺标本，其中41份通过直接免疫荧光法检测到HV抗原。

随着爱国卫生运动开展灭鼠，捕鼠的
工作难度也加大，捕鼠时间过长，现场解剖不及时，基层冷冻保存的条件有限等原因，导致我们收到标本时大部分的标本已经发黑甚至腐烂。

我们选取了15份较新鲜和份量较多的HV阳性鼠肺标本进行了病毒分离，最终成功分离出2株HV，通过S和M片段序列分析表明，这两株病毒同为SEOV。

这两株病毒均来自新建县
的褐家鼠(该县共4份标本用于病毒分离)。

分析原因，新建县的采样点离本实验室最近，标本采集当天立即送往实验室放入-70 ℃保存，由此我们认为标本的采集保存和运输过程对HV的病毒分离率存在很大的影响。

为了保证原始标本质量，提高病毒分离率，最好能携带液氮罐到基层采样，及时将采集标本置液氮保存。

HV基因组L、M、S 3个基因片段分别编码 RNA 依赖的 RNA 聚合酶、糖蛋白(GP)Gn 和 Gc 的前体糖蛋白及核衣壳蛋白(NP)。

在HV 3个片段中M片段的重组率较高，可能与M基因编码的糖蛋白承受来自HV宿主免疫压力最大有关[10]；L 片段最保守，这可能是L片段编码蛋白功能的保守性需要所致[11] 。

自从1984年江西分离到L99和C94株HV以后，时隔30年再次分离到HV，因此为了解现今分离毒株基因特点和遗传变异情况，我们选择S和M片段进行基因序列分析。

JiangxiXinjianRn-09-2011与国内外其他SEOV核苷酸同源性为94.8%～98.0%，
但氨基酸的同源性在98%以上。

与 L99株S片段核苷酸同源性为95.7%，氨基酸同源性为99.3%；M片段核苷酸和氨基酸同源性分别为95.2%、98.7%，说明年代对SEOV的基因变化影响不大；JiangxiXinjianRn-09-2011与国际标准株80-39株的S片段只发生一个氨基酸位点变异，变异率0.23%；M片段有9个氨基酸位点变异，变异率为0.79%，但糖基化位点的数目和位置没有发生变化。

结果表
明褐家鼠携带的SEOV基因变异较小，相对稳定。

这也为疫苗保护效果和HFRS
防控提供了有利的分子生物学依据。

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