江西省汉坦病毒分离及其S和M基因特征分析

江西省汉坦病毒分离及其S和M基因特征分析

刘师文;徐刚;施勇;龚甜;李健雄;刘晓庆;熊英

【摘要】目的对2011年江西省采集的鼠肺标本进行汉坦病毒的分离鉴定,了解分离病毒株的基因特征.方法采用Vero-E6细胞对阳性鼠肺标本进行病毒分离,采用直接免疫荧光法和RT-PCR方法对毒株进行鉴定.扩增分离株的S、M片段基因进行克隆测序.运用DNAstar软件包和MEGA3.1软件对序列进行分析.结果从15份标本分离到2株来自褐家鼠的汉城型汉坦病毒.对其中1株病毒的S、M片段进行了克隆和序列测定,其中S片段含1 772个核苷酸,编码429个氨基酸;M片段含3 651个核苷酸,编码1 133个氨基酸.经核苷酸和氨基酸同源性分析,新分离株与国内外汉城型病毒核苷酸同源性94.8％～98.0％,氨基酸同源性98.2％～99.6％.与汉城型标准株80-39株相比,S片段仅1个氨基酸位点发生变异;M片段有9个氨基酸位点发生变异,糖基化位点的数目和位置没有发生变化.结论从江西省褐家鼠分离到两株汉城型病毒,病毒基因变异较小,型别相对稳定.

【期刊名称】《中国人兽共患病学报》

【年(卷),期】2015(031)012

【总页数】6页(P1157-1161,1199)

【关键词】汉坦病毒;病毒分离;M基因;S基因;序列分析

【作者】刘师文;徐刚;施勇;龚甜;李健雄;刘晓庆;熊英

【作者单位】江西省疾病预防控制中心,南昌 330029;江西省疾病预防控制中心,南昌 330029;江西省疾病预防控制中心,南昌 330029;江西省疾病预防控制中心,南昌

330029;江西省疾病预防控制中心,南昌 330029;江西省疾病预防控制中心,南昌330029;江西省疾病预防控制中心,南昌 330029

【正文语种】中文

Support by the Provincial Health Department of Jiangxi Province (No. 20123156)

汉坦病毒(Hantavirus，HV)属布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantavirus)，是有包膜的负链 RNA 病毒。HV基因组由大(L)、中(M)、小(S)3个基因片段组成。目前已经有40多个血清型或者基因型，并且至少有22个型的HV能引起人类疾病[1-2]。

鼠类等啮齿动物是HV的自然储存宿主，人类主要通过吸入受感染动物的分泌物或排泄物而获得病毒感染。在世界上很多国家，鼠源的HV感染导致的人类肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)或汉坦病毒肺综合症是非常重要的人兽共患病。中国是HFRS流行最严重的国家之一，发病数和死亡数在全世界最多[3-4]。

目前国内外已分离到很多HV，江西地区早在20世纪80年代就由刘佩琴等人分别从社鼠和罗赛鼠中分离到HV C94株和 L99株[5]。L99株曾作为疫苗株制备肾综合征出血热地鼠肾灭活疫苗[6]。之后再未见江西地区分离到HV的报道，关于HV的检测一直停留在免疫检测水平。本研究对2011年采集的HV阳性鼠肺标本进行病毒分离，并对分离株进行了S和M片段基因测序分析，以了解我省HV的基因特征和遗传变异情况，为HFRS的防控提供科学依据。

1.1 标本来源于2011年春秋季，在江西省高安、安义、新建、上饶、上高和浮梁县(市)捕鼠，共捕获鼠类616只鼠，对鼠肺进行了直接免疫荧光HV抗原检测，从41份HV阳性鼠肺中选取15份保存较好的鼠肺标本进行病毒分离。

1.2 主要试剂和材料Vero-E6细胞来自中国疾病预防控制中心病毒病所出血热室，荧光素标记的汉坦病毒抗体、(第四军医大学)、小牛血清(杭州四季青)、胎牛血清(GIBCO)、MEM(GIBCO)、Rneasy Mini Kit (Qiagen)、SuperScript® Ш First-Strand synthesis system for RT-PCR(Invitrogen)、2 000 bp DNA Marker、Pyrobest® DNA Polymerase(TaKaRa)、聚合酶链反应(PCR)相关试剂(Promega)和细胞刮刀(Corning)。

1.3 病毒分离将HV阳性的鼠肺标本经液氮研磨后用MEM溶液(含1%青霉素和

链霉素，pH7.4)制成10%悬液，3 000 g离心10 min，取1 mL上清接种于

Vero-E6细胞，37 ℃孵育2 h；吸去残留液体加入2%牛血清的维持液，37 ℃培养。每3～4 d换1次维持液，28 d传代1次。分别在每代第7、14、21、28 d

用细胞刮刀刮取少量细胞涂片进行直接免疫荧光检测。连续传代3次仍为HV阴

性者，则放弃培养。

1.4 培养物的直接免疫荧光检测用细胞刮刀刮取少量细胞至载玻片，在生物安全

柜干燥，冷丙酮固定20 min，PBS冲洗2次，蒸馏水漂洗1次，吹干，加荧光素标记汉坦病毒抗体，置湿盒内37 ℃孵育30 min取出， PBS冲洗3次，蒸馏水漂洗1次，吹干，甘油封片后在荧光显微镜下观察结果。

1.5 核酸提取、扩增、克隆和测序对出现免疫荧光阳性结果的培养物，采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit提取，具体步骤参照产品说明书。引物见表1，逆转录及汉坦病毒鉴定引物和方法参照2004版《全国肾综合征出血热监测方案(试行)》。采用P14引物及SuperScript® Ш First-Strand synthesis system for RT-PCR试剂盒合成cDNA，反应体系和反应条件参照试剂盒说明书。S片段采用1对引物，M片段采用2对引物扩增，PCR反应条件：95 ℃ 变性5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min，共扩增40个循环，72 ℃延伸 20 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，目的片段扩增产物送上海生工生物工程有限公司