用PCR技术检测直接从粪便中提取真菌DNA的实验研究_吴浩

近年来，随着胃肠道菌群失衡引起的肠道真菌 病发病率、死亡率的不断增高及越来越多的耐药菌 株出现，使我们认识到早期、快速诊断肠道真菌病， 并且在最短时间内将致病菌鉴定到种，以选择敏感 有效的药物进行治疗，是院内肠道真菌感染治疗成 功的关键。 由于大多数实验室建立的检定方法[1, 2]是 将临床粪便标本在培养阳性的基础上再用分子生物 学技术将致病菌鉴定到种，这意味着必须等待数天 甚至数周才能将菌株鉴定到种。 并且有些真菌如曲 霉等并不会在这些培养基上生长，使得培养阴性的 含菌标本不能被用来检定菌种。 这就限制了该方法 的应用范围。 本文旨在寻找一种适合于临床对真菌 的快速诊断的粪便真菌 DNA 抽提方法。
2.3 PCR 结果 5 份在沙氏培养基上培养阴性的粪便标本，锆
珠+酚-氯仿法抽提的 DNA，PCR 结果全为阴性，即 未检测到真菌 DNA。 而同样的标本，用 QIA+玻珠法 抽 提 粪 便 DNA，经 PCR 扩 增, 除 一 份 S5 标 本 扩 增 结果为阴性外，其余 4 份标本均扩出产物。 结果见
摘 要：目的 用 PCR 技术评价从粪便标本中直接抽提病源真菌 DNA 的方法。 方法 用玻璃珠击打法+QIAamp○R 粪便 DNA 试
剂盒（玻珠法+QIA）和酚-氯仿+锆珠法分别直接抽提在沙氏培养基上培养为阴性的 5 份肝硬化失代偿患者的粪便标本，然后用
真菌通用引物进行 PCR 扩增比较。 结果 QIA+玻珠法直接抽提粪便真菌 DNA 优于酚-氯仿+锆珠法，且从标本处理到报告结
1 材料与方法 1.1 标本来源与标本选取 1.1.1 患 者 来 自 江 西 省 武 宁 县 人 民 医 院 2007 年 12 月～2008 年 12 月间已诊断为肝硬化失代偿共 19 例，男 9 例，女 10 例；年龄 32～75 岁。 每隔一周，分 别收集肝硬化失代偿患者粪便，用 1.5ml EP 管分装 成 2 份，300mg/份， 上述粪便标本均在 1h 内处理完 毕 ， 其 中 一 份 立 即 保 存 于 -80℃ 备 用 ， 余 下 一 份 于 沙 氏培养基 30 ℃培养 6～7d。 1.1.2 选取 5 份在沙氏培养基上培养阴性的粪便 标本， 用 QIA+玻珠法和酚-氯仿+锆珠法分别对其 抽提真菌 DNA。 1.1.3 用 QIA+玻 璃 珠 法 直 接 抽 提 在 沙 氏 培 养 基
是 2 型糖尿病致残、致死的主要原因，其大血管病变 为动脉粥样硬化，主要累及主动脉、冠状动脉、肢体 大动脉、颈动脉等，而糖尿病的微血管病变是糖尿病 特有的慢性并发症，表现为视网膜、肾等微血管病 变。 T2DM 的微血管并发症的机制复杂，可能与多元 醇通路活性增高，蛋白糖基化终未产物形成增加及 己糖胺通路活性增高有关，大血管并发症主要与糖、 脂、尿酸代谢系乱及血管内皮细胞损害等有关[3,4]。
第 28 卷第 3 期 2010 年 6 月
实验与检验医学 EXPERIMENTAL AND LABORATORY MEDICINE
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·实验研究·
用 PCR 技术检测直接从粪便中提取真菌 DNA 的实验研究
吴 浩 1，陈珍晶 2
（1、武宁县人民医院检验科，江西 武宁 332300；2、浙江大学医学院附属第一医院）
图 1。 3 讨论 肝硬化患者因其机体免疫功能低下极易发生感
染，在临床上肝硬化患者的肠道真菌感染呈逐年增 多 趋 势[6]，所 以 本 文 选 取 肝 硬 化 失 代 偿 患 者 的 粪 便 为标本，以期对肝硬化患者肠道真菌感染的特点及 防治方法做进一步的研究。 目前，大多数实验室对 粪便标本真菌种属检定基本都是在沙氏培养基或酵 母提取液上培养阳性的基础上再用分子生物学技术 分析[1, 2]。 这就使得其有以下几个局限性 （1）不能反 映真菌在胃肠道内最原始的状态。 （2）易造成漏检， 肠道微生态失衡而引起肠炎的真菌主要有假丝酵母 菌、放线菌、毛霉菌、曲菌、隐球菌等，除了假丝酵母 菌易在沙氏培养基或酵母提取液上生长外，其它真 菌都不易被培养出来。 （3）培养时间过长，一般要数 天到数周。
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Tris, pH 9.0，20mM EDTA，10mM NaCl，1%SDS) 中 ， 加入 15μl 蛋白酶 k (10U/ml)， 水浴 56℃，1h。 加入 150mL 苯酚和 0.2g 玻璃珠（0.1mm；SIGMA），然后用 FastPrep○R FP120 快速核酸提取仪， 最大转速 30s 击打 3 次（30s×65）。 将上清加入一个新的 1.5ml 的 EP 管内，加入 200μl 苯酚和 200μl 氯仿，颠倒混匀， 13000r/min 离 心 15min。 将 上 清 转 移 到 一 个 新 的 1.5ml EP 管内，加入 400μl 氯仿，颠倒混匀，13000r/ min 离心 15min。将上清液转移到一个新的 1.5ml EP 管内，加入 0.6 倍体积异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃ 放 置 1h 或 过 夜 进 行 沉 淀 。 14000r/min 离 心 样 品 20min，倒 掉 上 清 液 ，样 品 放 在 冷 冻 干 燥 机 内 ，干 燥 15 ～30min。 溶 于 100μl Tris -EDTA buffer (10mM Tris，1mM EDTA, pH 8.0)。20μl 每管分装收集 DNA， -80℃保存。
1.5 阳性对照和阴性对照 阳性对照为近平滑假丝 酵 母 菌 （ATCC22019），
购自浙江省临床检验中心。 阴性对照为高压后的双 蒸水。
2 结果 2.1 收集结果及培养结果
本文共收集到 19 例 肝 硬 化 失 代 偿 患 者 的 粪 便 标本，共 27 份。 产色沙氏培养基及 Vitek 60 全自动 细 菌 鉴 定 仪 鉴 定 的 结 果 是 27 份 标 本 中 有 19 份 阳 性。 其中近平滑假丝酵母菌 1 株，光滑假ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ酵母菌 2 株，热带假丝酵母菌 1 株，白假丝酵母菌 15 株。
玻 壁 管 内 （玻 壁 管 由 Fast DNA○R Kit 提 供 ）， 加 入 1.4mlASL 和 0.3g 玻 璃 珠 （(0.1mm；SIGMA）， 用 振 荡 器 混 匀 ，95℃ 水 浴 10min， 然 后 用 FastPrep ○R FP120 快速核酸提取仪， 最大转速最长时间击打一 次 （45s×65）。 75℃水 浴 5min 后 离 心 沉 淀 （15000r/ min，10min）， 取上清， 加药片， 振荡器混匀后静置 10min 左 右 。 离 心 沉 淀 （15000r/min，10min）后 吸 上 清，平衡称重(用去离子水或 ASL 平衡) 再离心沉淀 （15000r/min，3min）。 另取 1.5mlEP 管，先加入 15μl 蛋白酶 k，再加入上步提取的上清 200～300μl，最后 加入与上清同体积的 AL。 70℃水浴 30min 后加入与 上清同体积的无水乙醇。 振荡器混匀后， 离心 （15000r/min，1min），取 上 清 加 入 过 滤 柱 中 ， 再 离 心 （15000r/min，1min）， 将 剩 下 的 上 清 继 续 加 入 过 滤 柱 中，直至加完,空甩（15000r，10min）。 加 500μl AW1 离 心 （5500r/min，5min）。 再 加 500μl AW2 离 心 （5500r/min，5min） 空 甩 （15000r/min，10min） 后 静 置 2min 左右。 将过滤柱转接到剪去盖头的灭菌 1.5ml EP 管中，加入预 热 好 的 AE 200ml（将 DNA 洗 脱 入 EP 管 中 ） 静 置 2min 后 4℃ 离 心 （15000r，10min）。 20μl 每管分装收集 DNA，-80℃保存。锆珠+酚-氯仿 法[4]：本文的粪便标本是 300mg，Goldenberg O 等[4]文 中 的 粪 便 标 本 是 1g， 其 它 的 试 剂 与 步 骤 [4]如 下 ： 将 300mg 的 粪 便 标 本 溶 入 1ml 裂 解 缓 冲 液 (500mM
图 1 Mr(Marker)为 DL2000，NC 为 阴 性 对 照 ，pc 为 阳 性 对 照 ； 泳 道 1～5 为锆珠+酚-氯仿法的 PCR 扩增结果；泳道 6～10 是 QIA+玻珠法 的 PCR 扩 增 结 果 ；泳 道 1、6，标 本 S1；泳 道 2，7，标 本 S2；泳 道 3、8， 标本 S3；泳道 4、9，标本 S4；泳道 5、10，标本 S5。
作者简介：吴浩，男，1964 年 出 生 ，浙 江 宁 波 人 ，主 管 技 师 ，毕 业于南昌大学医学院本科，从事生化、分子生物学研究。
上培养阳性的粪便标本的 真 菌 DNA， 作 为 阳 性 对 照。
1.2 DNA 提取 QIA+玻珠 法[3]：将 300mg 粪 便 加 入 带 螺 旋 盖 的
1.3 DNA 产量以及纯度的测定 QIA+玻珠法提取的 DNA 和锆珠+酚-氯仿法提
取 的 DNA 用 紫 外 分 光 光 度 计 测 定 其 吸 光 值 A260 和 A280，并计算出 A260/A280 值。 通过 A260 计算 DNA 的产量；A260/A280 值评价 DNA 的纯度。
1.4 PCR 反应程序及扩增产物检测 真 菌 SSU rDNA 通 用 引 物 为 ： (5’ -ATTG-
GAGGGCAAGTCTGGTG, 5’-CCGATCCCTAGTCGGCATAG)[5]，由上海英骏生物公司合成。 PCR 扩增的 条 件 是 ：94℃ 预 变 性 4min， 然 后 94℃ 30s、62℃ 1min、72℃ 2min，循环 35 次，72℃延伸 5min。 取 5μl 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB 染色， 透射紫外 灯下观察、照像。
HbA1C 水平均明显高于 C 组患者(P＜0.01)。 三组间 的 SUA 水 平 比 较 ，A 组 患 者 SUA 水 平 高 于 B 组 和 C 组，差异有统计学意义（P＜0.01），B 组患者 SUA 水 平与 C 组比较差异无显著性（P＞0.05）。
3 讨论 糖尿病血管并发症（大血管病变和微血管病变）
为了克服这几点， 本文用 PCR 技术比较 QIA+ 玻珠法与锆珠+酚-氯仿法对 5 份在沙(下转第 256 页)
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2.2 DNA 产量以及纯度 紫 外 分 光 光 度 计 测 定 显 示 QIA+ 玻 珠 法 和 锆
珠+酚-氯仿法均能提到 5 例粪便中的总 DNA，其中 QIA + 玻 珠 法 提 取 5 例 粪 便 总 DNA 平 均 得 率 是
116.3±1.5ng/μl，而锆珠+酚-氯仿法提取 5 例粪便总 DNA 平均得率是 41.7±1.5ng/μl，两种方法的总 DNA 所得率有显著差异(P＜0.05)。 纯 DNA 的 A260/A280 为 1.8，低于 1.8 则表明 DNA 中有蛋白质污染，高于 2.0 则表明 DNA 中有 RNA 污染。 QIA+玻珠法提取 的 5 例 粪 便 总 DNA 的 A260/A280 的 范 围 是 1.82～ 1.97 之间，锆珠+酚-氯仿法提取的 5 例粪便总 DNA 的 A260/A280 的范围是 1.73～2.52 之间。
果仅需 6～7h。 结论 用玻珠法+QIA 法简单、快速、灵敏，可从粪便标本中直接抽提病原真菌 DNA，进行 PCR 检测，有助于对真
菌的快速诊断。
关键词：真菌 粪便 DNA
中图分类号 R379,R446.13
文献标识码 A 文章编号 1674-1129(2010)03-0249-02
doi:10.3969/j.issn.1674-1129.2010.03.017