饲料分析与检测技术课程论文
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黄曲霉毒素的检测方法研究
应用化学 20096842 杨兰森
摘要:黄曲霉毒素(AFT)是一类有毒致癌化合物,污染粮食及其制品,给人类健康造成严重威胁。黄曲霉毒素(AFT)是迄今发现的毒性最强的一类生物毒素,有
AFB
1、AFB
2
、AFG
1
、AFG
2
等多种形式。本文介绍了黄曲霉毒素的理化性质,对人
和动物的危害等,并且对目前用于黄曲霉毒素的检测方法进行了综述。在对薄层层析法、高效液相色谱法、微柱法及酶联免疫吸附法等检测方法综合分析的基础上,评述了上述方法的优劣和适用条件。
关键词:黄曲霉毒素危害检测方法进展
黄曲霉毒素(AFT)主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢物。在世界不同地区都发现了这些真菌大量存在于供人类食用的食品中,黄曲霉毒素污染已导致严重的食品安全问题[1,2]。自20世纪60年代以来,有关黄曲霉毒素的危害被大量报道,以致黄曲霉毒素已成为最受人们关注的一种真菌毒素[3]。阐明黄曲霉毒素的治病机理,快速,准确地检测食品中黄曲霉度的含量,并制定相应的标准,采取适当的预防措施来降低其危害已成为近来食品、饲料检测研究的重点。
1 黄曲霉毒素概述
1.1 黄曲霉毒素的理化性质
黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物,目前已分离鉴定出12种,包括B1,B2,G1,G2,M1,M2,P1,Q,H1,GM,B2a和毒醇[4]。黄曲霉毒素的的基本结构为二呋喃环和香豆素,B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物,即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素),前者为基本毒性结构,后者与其致癌性有关[5]。M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。黄曲霉毒素的主要分子形式含B1,B2,G1,G2,M1,M2等,其中M1和M2主要存在于牛奶中,B1为毒性及致癌性最强的物质。
黄曲霉毒素难溶于水、己烷、乙醚和石油醚,易溶于甲醇、乙醇、氯仿和二甲基甲酰胺等有机溶剂,分子量为312-346,熔点为200-300℃。黄曲霉毒素耐高温,通常加热处理对其破坏很小,只有在熔点温度下才发生分解。黄曲霉毒素遇碱能迅速分解,但此反应可逆,即在酸性条件下又复原。一般来说,温度30℃、相对湿度80%、谷物水份在14%以上(花生的水份在9%以上)最适合黄曲霉繁殖和生长。在24-34℃之间,黄曲霉菌产毒量最高[6]。几乎所有谷物、饲草和各种食品(包括畜产品)都可作为黄曲霉基质[7]。
1.2 黄曲霉毒素与动物疾病和人类健康
黄曲霉毒素中毒主要对动物肝脏的伤害,受伤害的个体因动物种类年龄、性别和营养状态而异。研究结果表明,黄曲霉毒素可导致肝功能下降,降低牛奶产量和产蛋率,并使动物的免疫力降低,易受有害微生物的感染。此外,长期食用含低浓度黄曲霉毒素的饲料也可导致胚胎内中毒,通常年幼的动物对黄曲霉毒素更敏感。黄曲霉毒素的临床表现为消化系统功能紊乱,降低生育能力,降低饲料利用率,贫血等。黄曲霉毒素不仅能够使奶牛的产奶量下降,而且还使牛奶中含有转型的黄曲霉毒素M1和M2。据美国农业经济学家统计,由于食用黄曲霉毒素污染的饲料,每年至少要使美国畜牧业遭受10%的经济损失。在我国由此而带来的畜牧业损失可能会更大。
人类健康受黄曲霉毒素的危害主要是由于人们食用被黄曲霉毒素污染的食物。对于这一污染的预防是非常困难的,其原因是由于真菌在食物或食品原料中的存在是很普遍的。国家卫生部门禁止企业使用被严重污染的粮食进行食品加工生产,并制定相关的标准监督企业执行,但对于含黄曲霉毒素浓度较低的粮食和食品无法进行控制。在发展中国家,食用被黄曲霉毒素污染的食物与癌症的发病率呈正相关性。亚洲和非洲的疾病研究机构的研究工作表明,食物中黄曲霉毒素与肝细胞癌变呈正相关性,长时间食用含低浓度黄曲霉毒素的食物被认为是导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病的主要原因[8]。1988年国际肿瘤研究机构将黄曲霉毒素B1列为人类致癌物。
2 黄曲霉毒素的检测方法
黄曲霉毒素的检测方法从最初以薄层层析法为主,发展到高效液相色谱法、微柱法、酶联免疫吸附法等多种方法普遍应用,其进展与新的化学检测手段和新仪器的出现密不可分。这些新方法、新手段的快速应用,为黄曲霉毒素的检测提供了更广泛的选择余地,适应了不同的检测目的和要求。
2.1薄层层析法(TLC)
薄层层析法是测定黄曲霉毒素的经典方法,其原理是将样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层分离后,在波长365 nm紫外光下产生蓝紫色或黄绿色荧光,并根据其在薄层上显示的最低检出量来确定其含量。
聂孝同等[9]应用薄层层析法采用以下步骤对饲料中的黄曲霉毒素进行了检测。首先是黄曲霉毒素的提取:把粉碎过20目筛的样品放人具塞三角瓶中,加入
甲醇(55:45)溶液,再加入石油醚盖严,静置片刻后,用慢速定量滤纸过滤于分液漏斗中,通人三氯甲烷,再过滤并将滤液在65℃水浴上通风挥干,冷却后加入苯一乙腈(98:2)充分混合,然后吸取上清液待用。对杂质少的样品,采取直板定性。依次点板、展开、观察;其中预展展开剂为无水乙醚,正展展开剂为丙酮一三氯甲烷(1:9),且展开剂要事先加入到展开槽内;通过观察,无荧光出现为阴性.出现荧光则为阳性,需作直板确证,若继续有荧光出现,则进一步作定量确证;样品的某一点荧光强度与标样点的荧光强度相一致,则取此点为样本的黄曲霉毒素含量值,否则作稀释定量检测;但是对于杂质多的样品,须采取横板定性;同样经过点板、展开、观察,有荧光者为阳性检出,进一步作横向确证,经再次检测观察呈阳性,则需要定量确证黄曲霉毒素含量。
为了提高薄层层析法的精度,建立薄层扫描法来测定黄曲霉毒素,它是薄层层析法的仪器化,样品的处理和层析条件与薄层层析法相同,只是在标准品的设定和结果判定上有所不同。杨焱等[10]把粉碎过筛的样品加水湿润后通人氯仿过滤,取滤液在65℃水浴上挥干,再用苯一乙脯溶液转移;通过点板,用乙醚预展后,再用氯仿一丙酮(92:8)展开,在365 nm紫外光下观察,根据AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分别显示的蓝紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光,在扫描仪上绘制AFrr 扫描图谱,并由此分辨出黄曲霉毒素种类;最后作定量分析:以斑点面积积分值为纵坐标,标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线,建立回归方程,得到样品的黄曲霉毒素浓度。
2.2 高效液相色谱法(HPLC)
用高效液相色谱法测定黄曲霉毒素,一般分提取、净化、衍生和测定几个步骤。
提取通常是黄曲霉毒素分析的第一步,所用的仪器和溶剂有很多种[2,11]韩红岩等[12]对于受黄曲霉毒素污染不同程度的玉米用60%甲醇、80%丙酮、90%乙腈提取,均得到较高的回收率,其中,80%丙酮的毒性与乙腈、甲醇相比较小,操作较为安全,是提取黄曲霉毒素的最佳选择;王光建等[13]给样品中加入甲醇(6:4)溶液,高速捣碎,将提取物于离心管离心5~10 min后,给上清液中加入氢氧化铁悬浮液搅匀,再加人Tris一盐酸缓冲液,离心后待用;李佐卿等[14]首先加人氯化钠,再加人甲醇(1:9)超声震荡,经0.45um滤膜过滤即可,而加人氯化钠