分光光度法测定叶绿素含量及其比值问题的探讨

波长偏差对叶绿素ｂ含量测定的影响显著大于 叶绿素ａ含量的测定， 因此相应地影响了Ｃｈｌ ａ／Ｃｈｌ ｂ的比值， 波长红移时引起Ｃｈｌ ａ／Ｃｈｌ ｂ的值偏低， 波 长蓝移时引起Ｃｈｌ ａ／Ｃｈｌ ｂ的值偏高， 当波长偏差达 到２ ｎｍ时， 会导致Ｃｈｌ ａ／Ｃｈｌ ｂ产生显著偏离（表３）。
无论是玉米（Ｃｈｌ ａ／Ｃｈｌ ｂ≈３．７）还是水稻（Ｃｈｌ ａ／Ｃｈｌ ｂ ≈３）， 叶绿素混合溶液在红光区的吸收光谱（图３）都 只呈现一个明显的吸收峰， 只是在短波方向的半峰
实验结果
１ 叶绿素的分离与纯化 水稻叶片的混合色素经硅胶Ｇ６０薄层分离后可
得到７种不同的色素斑点（图１）， 从展开剂端至点样 端依次为： β－ 胡萝卜素、去镁叶绿素 ａ、叶绿素 ａ、叶绿素 ｂ 、叶黄素、紫黄质和新黄质， 这与 已有的研究结果（彭光华等１９９８； 果秀敏等２０００）相 吻合。将分离得到的叶绿素 ａ 和叶绿素 ｂ 分别用 ８０％丙酮抽提后测定其在红光区的吸收光谱（图２）， 其峰型对称， 与相应的标准图谱一致， 说明经层析 分离得到的叶绿素 ａ、ｂ 具有较高的纯度， 再于暗 中低温真空干燥后得到的粉状物作为叶绿素 ａ、ｂ “ 标准品 ” 的参照品。
祥草的功能叶片， 用８０％丙酮研磨抽提得到叶绿素 混合溶液， 采用２种具有波长自动校正功能的双光 束分光光度计测定叶绿素含量的结果（表２）表明， 对 于最大吸收波长为 ６６３ ｎｍ 的叶绿素 ａ 而言， 波长 偏差在２ ｎｍ以内时， 对定量测定值的影响不显著； 但波长偏向长波（６６５ ｎｍ）时， 对叶绿素ａ测定值的
收稿 ２００８－０９－０８ 修定 ２００８－１２－０４ 资助 大学生科技创新项目和湖北省高等学校教学研究项目
（２００４０１４４）。 ＊ 通讯作者（Ｅ－ｍａｉｌ： ｗａｎｇ－ｘｕｅｋｕｉ＠ｍａｉｌ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ； Ｔｅｌ：
０２７－８７２８２１３０）。
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公司提供）。利用上述实验材料的功能叶片测定叶 绿素含量。 ２ 实验方法 ２ ． １ 叶绿素的分离与纯化 以水稻剑叶作为分离、 纯化叶绿素的材料。叶绿素的提取和分离参照果 秀敏等（２０００）的方法并进行适当修改。将水稻功 能叶片（剑叶）置于石油醚（３０￣６０ ℃）－无水乙醇（３：２， Ｖ／Ｖ）混合溶液中研磨成浆状， 转移至分液漏斗中， 加 入等体积的蒸馏水洗去水溶性物质和乙醇， 静置分 层（必要时加少量的饱和ＮａＣｌ溶液）， 取出含色素的 石油醚溶液并置于暗中备用。将硅胶 Ｇ６０ （青岛海 洋化工厂， 薄层层析用）与蒸馏水按１：３的比例研磨 成浆状后涂布薄层板， 晾干， 于１１０ ℃下活化１￣２ ｈ 后用于叶绿素的薄层分离。流动相为石油醚 （３０￣６０ ℃）－丙酮－苯（２：１．５：２， Ｖ／Ｖ）混合液。分离 后的叶绿素 ａ、ｂ 分别用丙酮抽提， 在暗中真空干 燥后作为参照品。 ２ ． ２ 叶绿素含量测定 在暗中用８０％丙酮提取叶绿 素后用分光光度法测定叶绿素含量（王学奎２００６）并
提要： 本文以水稻、棉花、玉米以及喜荫植物吉祥草为材料， 采用分光光度法比较了不同性能的分光光度计对叶绿素含量 及其比值测定的影响。结果表明， 狭缝宽度过小或过大均导致叶绿素定量结果的相对误差增大， 但仪器的波长偏移是引起 测定结果误差的主要原因。波长偏差超过１ ｎｍ时会影响混合溶液中叶绿素ｂ的定量结果以及叶绿素的相对比值（Ｃｈｌ ａ／Ｃｈｌ ｂ）， 波长“蓝移”引起Ｃｈｌ ａ／Ｃｈｌ ｂ 偏高， 波长“红移”则导致Ｃｈｌ ａ／Ｃｈｌ ｂ 偏低。波长偏移及波长重现性差是造成Ｃｈｌ ａ／Ｃｈｌ ｂ 比 值偏离其 “ 理论比值 ”、导致测定数据之间缺少可比性的原因。选择具有波长自动校准功能、波长精度高、狭缝宽度在 １￣２ ｎｍ 的分光光度计用于叶绿素含量及其比值的测定则可获得可比性强、重现性好、准确度高的结果。 关键词： 分光光度法； 叶绿素含量； 叶绿素比值
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分光光度法测定叶绿素含量及其比值问题的探讨
袁方， 李鑫， 余君萍， 王学奎＊， 徐久玮， 张立新
华中农业大学植物科技学院中心实验室， 作物生理与栽培研究中心， 武汉， ４３００７０
Methodological Study on Determination of Chlorophyll Contents and Ratio of Chl a/Chl b by Spectrophotometry
宽明显增加； 即使是对于Ｃｈｌ ａ／Ｃｈｌ ｂ接近２的喜荫 植物吉祥草而言， 叶绿素ｂ在红光区的吸收也只出 现一个不很明显的肩峰（图 ３ 曲线 ３）。除了叶片中 叶绿素ｂ的含量相对较低外， 其他原因就是叶绿素 ｂ 在红光区的摩尔吸光系数明显小于叶绿素 ａ 且两 者的吸收峰之间相互重叠。因此， 从叶绿素混合溶
表 ３ 波长偏差对叶绿素 ａ与叶绿素 ｂ相对比值的影响
本文探讨了不同厂家的性能不同的分光光度 计对测定植物叶绿素含量以及叶绿素 ａ、ｂ 之间相 对比值的影响， 以供相关研究者参考。
材料与方法
１ 实验材料 实验材料为水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）、棉花
（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．）、玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．） （分别 由本校水稻组、棉花组和玉米组提供）和喜荫植物 吉祥草（Ｒｅｉｎｅｃｋｉａ ｃａｒｎｅａ Ａｎｄｒ． Ｋｕｎｔｈ） （由本校园林
表１ 狭缝宽度对叶绿素测定的影响
叶绿素 ａ
叶绿素 ｂ
狭 缝 宽 度 ／ ｎｍ 实测浓度 ／ｍｇ·L－１
平均值
±SＤ
实测浓度／ｍｇ·L－１
图１ 水稻叶片叶绿素层析分离图谱 １： β－胡萝卜素； ２： 去镁叶绿素ａ； ３： 叶绿素ａ； ４： 叶绿素ｂ； ５： 叶黄素； ６： 紫黄质； ７： 新黄质。
图 ２ 叶绿素 ａ 和叶绿素 ｂ 的红光区吸收光谱
的增加， 测定结果呈现减小的趋势； 狭缝宽度小于 ０．５ ｎｍ或大于４ ｎｍ时， 测定结果的相对误差均较 大。
计算叶绿素 ａ、ｂ 的相对比值， 重复 ３ 次。 实验中采用的分光光度计分别来自尤尼柯
（ＵＮＩＣＯ， 上海）、日立（ＨＡＴＡＣＨＩ） 、北京瑞利、 上海上分和上海光谱５个厂家， 前两种分别为固定 狭缝（１．８ ｎｍ）、波长精度为 ±０．５ ｎｍ 和可调狭缝 （０．１￣５ ｎｍ）、波长精度为 ±０．３ ｎｍ 的具有波长自 动校准功能的双光束分光光度计， 后三种分别为狭 缝宽度 ２、４、６ ｎｍ （波长精度均为 ±２ ｎｍ）的单 光束分光光度计。
２．９４９ （１１０．６２）ａ
表中数据系采用具有波长校准功能的双光束分光光度计 Ｕ－３０１０ （狭缝 ２ ｎｍ）和 ＵＶ－４８０２ （固定狭缝 １．８ ｎｍ）平行测定的平均值， 重 复 ３ 次； 数字右侧的小写字母不同表示 ５ ％ 水平上的显著性差异； 括号内的数据是以最大吸收波长下测得的叶绿素含量为基础计算的 百分比（ ％ ） 。
YUAN Fang, LI Xin, YU Jun-Ping, WANG Xue-Kui*, XU Jiu-Wei, ZHANG Li-Xin Crop Physiology and Production Center, Central Laboratory of College of Plant Science & Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
表２ 波长偏差对叶绿素含量测定的影响
水稻 波长／ｎｍ
玉米
吉祥草
叶绿素ａ含量／ｍｇ·L－１ 叶绿素ｂ含量／ｍｇ·L－１ 叶绿素ａ含量／ｍｇ·L－１ 叶绿素ｂ含量／ｍｇ·L－１ 叶绿素ａ含量／ｍｇ·L－１ 叶绿素ｂ含量／ｍｇ·L－１
０．６７ ０．１６ ０．０１ ０．０１ ０．０１ ０．０１
１．２９ ０．８６ ０．４３ ０．１４ １．００ １．８６
表中叶绿素 ａ 和叶绿素 ｂ 的配制浓度分别为 ６．５ ｍｇ·L－１ 和 ７．０ ｍｇ·L－１。
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２ 波长偏移对叶绿素含量及其比值的影响 选取 Ｃ３ 植物水稻、Ｃ４ 植物玉米和喜荫植物吉
２．５３５ （９５．０９）ｃｄ
百度文库
６４５
３．３９３ （１００．００）ｂｃ
１．８５３ （１００．００）ｂｃ
２．６６６ （１００．００）ｂｃ
６４６
３．５９７ （１０６．０１）ａｂ
１．９７７ （１０６．６９）ａｂ
２．８０７ （１０５．２９）ａｂ
６４７
３．８１７ （１１２．５０）ａ
２．１０１ （１１３．３８）ａ
影响程度明显大于短波（６６１ ｎｍ）偏离的影响。 就叶绿素混合液中最大吸收波长为６４５ ｎｍ的
叶绿素ｂ （８０％丙酮溶液中）而言， 波长偏离会严重 影响含量的测定。波长偏离 １ ｎｍ 时， 虽然对叶绿 素 ｂ 含量测定的影响程度尚未达到显著差异水平， 但与 ６４５ ｎｍ 下的测定结果相比， 其相对偏差达到 ４％￣７％； 一旦波长偏差达到 ２ ｎｍ 时， 则叶绿素 ｂ 含量测定结果的相对偏差大于 １０％， 差异显著。
叶绿素是绿色植物光合作用的基础物质， 可反 映植物的生长发育状况、生理代谢变化以及营养 状况， 并且可作为环境生理研究的参考指标。因 此， 叶绿素含量以及叶绿素 ａ、ｂ 的相对比值常常 用作研究植物生长发育的生理指标。
测定叶绿素含量的方法有离体法（如分光光度 法）和活体法（如叶绿素仪法） （苏正淑和张宪政 １９８９）。分光光度法具有准确度高的特点， 是叶绿 素含量测定过程中应用最广泛的方法。由于生产 分光光度计的厂家众多， 不同型号仪器间的性能差 异很大， 在测定叶绿素含量， 尤其是在叶绿素ａ与 叶绿素 ｂ 相对比值的测定过程中存在较大差异（杨 善元１９８３； 刘秀丽等１９９９； 牟晓玲２００４）， 因此影响 了叶绿素作为植物生长发育参考指标的可比性。
６６１ １０．２７４ （９８．２２）ａ
６．６８２ （９８．２１）ａ
５．５８７ （９８．６９）ａ
６６２ １０．４２７ （９９．６８）ａ
６．７８２ （９９．６８）ａ
５．６５０ （９９．８１）ａ
６６３ １０．４６０ （１００．００）ａ
６．８０４ （１００．００）ａ
５．６６１ （１００．００）ａ
６６４ １０．３４０ （９８．８５）ａ
将层析、纯化、真空干燥后的叶绿素 ａ 、ｂ 分别溶于８０％丙酮中， 在其最大吸收波长处于不同 狭缝（可调狭缝、双光束分光光度计）下测定吸光 度后， 参照相应的摩尔吸光系数计算出实测浓度（表 １）。结果表明， 较小的狭缝宽度（０．１和０．５ ｎｍ）下 测定结果的标准差（ＳＤ）较大， 狭缝宽度等于或大于 １ ｎｍ 时测定结果的标准差小； 但随着狭缝宽度
相对误差／％
相对误差／％
平均值 ±SＤ
０．１
６．５３
０．５
６．５２
１
６．５１
２
６．５１
４
６．４３
５
６．３９
０．５５ ０．１１ ０．０１ ０．０１ ０．０１ ０．０１
０．４６ ０．３１ ０．１５ ０．１５ １．０８ １．６９
７．０９ ７．０６ ７．０３ ７．０１ ６．９３ ６．８７
６．７３７ （９９．０２）ａ
５．５９８ （９８．８９）ａ
６６５ １０．０５５ （９６．１３）ａ
６．５６０ （９６．４１）ａ
５．４３９ （９６．０８）ａ
６４３
３．００２ （８８．４８）ｄ
１．６３４ （８８．１８）ｄ
２．４０３ （９０．１４）ｄ
６４４
３．１８９ （９３．９９）ｃｄ
１．７３６ （９３．６９）ｃｄ