核酸的物理化学性质

第15章、核酸的物理化学性质（上册P502）

本章重点：1、核酸的水解，2、核酸的紫外吸收，3、核酸的变性和复性

本章的主要内容：

（一）核酸的水解：

所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。

（1）酸水解：

糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。

（2）碱水解：

磷酸酯键易水解，RNA比DNA易水解，因为RNA核糖上有2‘-OH，水解过

程见P502。

（3）酶水解：

为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。

1.核酸酶的分类：

按底物专一性分为RNase（核糖核酸酶）和DNase（脱氧核糖核酸酶）。

按对底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用

点在末端）。

2.RNase：如牛胰核糖核酸酶（EC 2.7.7.16），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（Py）

-3‘-磷酸与其他核苷酸之间的连键。

3.限制性内切酶：为DNase。

剪裁DNA的工具，可用于核酸测序和基因工程。

在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。限制性内切酶往往与甲基

化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可

识别和降解外源DNA。

断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定

位点两条链切断后形成粘末端或平末端。

限制性内切酶命名：如E. coR Ⅰ，第1个字母E(大写)，为大肠杆菌(E.coli)

属名的第一个字母，第2、3两个字母co（小写）为种名头两个字母，第4

个字母R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。（二）核酸的酸碱性质：

核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见P505，具有酸碱性。

由于DNA酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。

（三）核酸的紫外吸收：

嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在240~290nm，最大吸收值在260nm附近（蛋白质最大吸收值280nm）。

（1）可用于测样品纯度（测吸光度A）：

A260/A280比值，纯DNA应大于1.8，纯RNA应达到2.0，若样品混有杂蛋白，比值明显降低。

对于纯样品，从260nm的A值即可算出含量。A值为1，相当于50μg/mL DNA双螺旋，或40μg/mL单链DNA（或RNA），或20μg/mL寡核苷酸。

（2）核酸的摩尔磷吸光系数ε（P）：为含有1克原子磷（30.98g）的核酸在260nm 处的吸光系数。

ε（P）= A / CL. = 30.98 A / W L

A：吸收值，C：每升溶液的磷摩尔数，C=W/30.98，L：比色杯内径。

一般天然DNA ε（P）为6600，RNA为7700~7800

由于双螺旋结构使碱基对的π电子云发生重叠，使紫外吸收比单链减少，由此可判断DNA是否变性。

DNA变性时ε（P）值升高，增色效应。

DNA复性时ε（P）值降低，减色效应。

核酸比所含核苷酸单体的ε（P）低40~45%。

（四）核酸的变性、复性及杂交：

（1）变性：核酸双螺旋区的氢键断裂变成单链，不涉及共价键的断裂。

降解：多核苷酸骨架上共价键（3‘，5‘-磷酸二酯键）断裂，分子量降低。

引起变性因素：热变性，酸碱变性，变性剂（如尿素，甲醛等）变性（竞争形

成氢键）。

DNA变性温度：又称熔点或熔解温度，为DNA双螺旋结构失去一半时的温度，用T m表示，DNA的T m一般为82~950C。DNA变性是爆发式的，变性

在一个很窄温度范围内发生。

P508 图14-4为DNA变性过程。

影响T m的因素：

1. DNA的均一性：均一则T m窄，如poly (A-T)，poly d(G-C)等，T m窄。

2. G-C含量：T m值与G-C含量成正比，G-C含量越高，T m值越高，因为

G-C间三个氢键。

G-C含量与T m关系的经验公式：

G-C% = (T m - 69.3) ×2.44

可由G-C含量计算T m或由T m计算G-C含量。

3. 介质离子强度：

离子强度较高时，DNA的T m值较高，DNA较稳定，因此DNA的保存在含盐（如1mol NaCl）缓冲溶液中。

RNA的变性：RNA分子中有局部双螺旋区，所以也可发生变性，只是T m值较低，且范围较宽

双链RNA变性几乎与DNA同。

（2）复性：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构的过程称为复性。

变性DNA在缓慢冷却时，可以复性的过程称为退火。加热变性的DNA为防止复性，需骤冷处理。

DNA复性，浓度越大复性越快，且具有多重复序列的复性快。

（3）核酸的杂交：不同来源的DNA热变性后慢慢冷却，若异源DNA之间某些区域有相同序列，则复性时会形成杂交DNA分子。

DNA与互补的RNA之间也可发生杂交。

核酸杂交应用广泛，可用来检测特殊核苷酸序列的一个或更多的DNA片断，将少量基因钓出，是基因芯片，基因探针的工作根据。