融合蛋白的纯化

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2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电 斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白 质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH 达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此 法很少单独使用，可与盐析法结合用。
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3、低温有机溶剂沉淀法
由于有机溶剂自由移动的离子较少，具有 较低的介电常数，所以会使溶液的介电常 数减小，从而增强偶极离子之间的静电引 力，进而使蛋白分子集聚沉淀。另一方面， 有机溶剂如果是水溶性的话，本身的水合 作用会破坏蛋白质表面的水合层（争夺水 分子），也促使蛋白质分子脱水而沉淀。
2.配体（Ligand）
亲和层析是利用配体和待 分离物质的亲和力而进行分离纯化的，所以选 择合适的配体对于亲和层析的分离效果是非常 重要的。理想的配体应具有以下一些性质： 1) 配体与待分离的物质有适当的亲和力 2) 配体与待分离的物质之间的亲和力要有较 强的特异性，对其它组分没有非特异性吸附作 用。
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融合蛋白的纯化步骤
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His融合蛋和蛋白的纯化 蛋白质表面的一些氨基酸，例如组氨酸等能够 与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+， Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用（螯合作 用）。因此偶联了合适金属离子的琼脂糖凝胶 就能够选择性的吸附那些含有组氨酸的蛋白和 对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。 利用这一原理，我们用通用性配基亲和层析法 纯化6x His fusion protein。基质与6x His fusion protein间产生了共价键，结合力强但特 异性差
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亲和沉析法的原理

亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力 而设计的层析技术。如抗原和抗体，蛋白质A与 一些鼠亚类抗体之间，均具有专一的亲和力，在 一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又 是可逆的，改变条件可将抗原抗体解离。当把可 结合的一对分子的一方(称配体)结合在惰性载体 上使其固相化，另一方随流动相流经该载体，双 方即结合为一整体。然后设法将它们解离，从而 得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。
融合蛋白的纯化
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以蛋白质的结构与功能为基础，从分子水平上认识生命 现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质， 首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的 制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理 不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别， 把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐 析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一 物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达 到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法 的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、 高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失或断裂。

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融合蛋白的纯化特点及其步骤

GST融合蛋白： pGEX载体表达的外源蛋白与GST融合，因此可以 通过谷胱甘肽（GSH）-琼脂糖亲和沉析进行纯化。 GST是一类以谷胱甘肽（r-谷氨酰半胱氨酰甘氨 酸——GSH）作为底物，通过形成硫醇尿酸失活 毒性小分子的酶。由于GST对底物的亲和力是亚 豪摩尔级的，因此GSH固化于琼脂糖形成的亲和 沉析树脂对GST及其融合蛋白的纯化效率很高。 可以用含游离的GSH的缓冲液洗脱结合的GST融 合蛋白。
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线性梯度浓度咪唑洗脱目的蛋白属于竞争
性洗脱。梯度降低pH，通过减弱蛋白与金 属离子的作用力洗脱蛋白。两者的作用原 理是不同的 。
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2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧 甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂 （二乙氨基乙基纤维素），当被分离的蛋 白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与 离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离 子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办 法将吸附的蛋白质洗脱下来。
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阴离子交换层析
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（二）根据蛋白质分子大小的差别 的分离方法
1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白 质分开。 超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其 他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上， 可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据 分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。 柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex gel）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。
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一、蛋白质分离纯化的一般程序
1. 破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来； 这也就是蛋白质分离纯化的前处理工作。当然如果我 们要分析分离的蛋白质存在于细胞的外分泌物中的时 候，就无需对生物组织进行破碎处理了，只需要用适 当的缓冲溶液将蛋白质抽提出来就行。 2. 用离心法将细胞的亚细胞颗粒（如核、线粒体、微粒 体或核糖体）及细胞碎片与溶液分开。 3. 应用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来。 4. 进一步应用层析法或电泳法使各种蛋白质分开。 5. 在适当条件下使蛋白质结晶或制成冻干粉。
4.可分离的目标分子
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亲和层析的洗脱
亲和层析的另一个重要的步骤就是要选择合适的 条件使待分离物质与配体分开而被洗脱出来。亲 和层析的洗脱方法可以分为两种：特异性洗脱和 非特异性洗脱。在洗脱时，选择一种和配体亲和 力较强的物质加入洗脱液，这种物质与待分离物 质竞争对配体的结合，在适当的条件下，如这种 物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基 本被这种物质占据，原来与配体结合的待分离物 质被取代而脱离配体，从而被洗脱下来。 特异性洗脱方法的优点是特异性强，可以进一步 消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨 率。
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蛋白质分离纯化中的注意事项：
1.首先要建立一个方便灵敏的分析方法。 2.分离步骤要尽可能少 3.尽量避免蛋白质在提纯过程中的变性：包 括六个方面
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尽量避免蛋白质在提纯过程中的变性
▼要求分离流程相当快速，同时分离过程通常要保持在低温 （4℃）条件下进行。 ▼尽量避免过度暴露于氧气中 ▼注意重金属离子对酶的失活作用 ▼避免一切过激因素（如过酸或过碱）对蛋白活性的影响 ▼提取液的浓度应维持在较高水平 ▲最后，还需要注意的是：有少数蛋白质需在高离子强度的 极性介质中保持活性，因此还需要想提取液中加入KCl、 NaCl、(NH4)2SO4
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（四）根据配体特异性的分离方法 －亲和色谱法
亲和层析法（affinity
chromatography）是 分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经 常只需经过一步处理即可使某种待提纯的 蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出 来，而且纯度很高。这种方法是根据某些 蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子 能特异而非共价地结合。
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亲和配体间是如何结合的

是两个分子之 间，其构形有 如积木般的互 补，会因为范 德华力的关系， 产生特异亲和 力.
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亲和沉析法的各项要素
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亲和沉析法的各项要素
1.良好的固相基质（Solid
Matrix）,如:聚丙烯 酰胺（polyacrylamide）、几丁质（chitin）、 聚苯乙烯（polystyrene）等。本试验是用琼 脂糖小珠（sepharose）。 基质是构成固定相的骨架。必须具备性质： 1) 具有较好的物理化学稳定性。。 2) 能够和配体稳定的结合。 3) 基质的结构应是均匀的多孔网状结构。 4) 基质本身与样品中的各个组分均没有明 显的非特异性吸附，不影响配体与待分离物 24 的结合。
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两性电解质载体(carrier
ampholytes) (1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力， 形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两 性电解质改变pH梯度。 (2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数， 以保持均匀的电场。 (3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去， 便于与生物大分子分开。 (4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应， 也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。
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配体要能够与基质稳定的共价结合 4) 百度文库体自身应具有较好的稳定性，在实验 中能够耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧 烈的条件，可以多次重复使用
3)
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3.Ligand与固相基质间之的耦合反应
Ligand与固相基质之间，须有功能基可提 供键结合反应︰ 固相基质-X + Y-Ligand → 固相基质-x-yLigand

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（三）根据蛋白质带电性质进行分 离
1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子 量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不 同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电 泳。
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原理
聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质 pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其 中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两 性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极 到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作 用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH 值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区 带。
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蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法


1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓 度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶； 当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先 后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中， 高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4 )有很强的水化 力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋 白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等 电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程 度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋 白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。