甲基化特异性PCR(MSP)原理与引物设计说明

MSP原理

其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。

引物设计原则

标准的PCR引物设计原则同样适用于硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP),除了标准PCR的一些参数外,“MethPrimer”应用3′端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱基对互补率、GC含量、解链温度(Tm),而且还提供了上游引物和下游引物的Tm区别,以及引物中最大允许的单核苷酸重复率。因为所有非甲基化的“C”都被转换成“T”,所以“MethPrimer”中默认的重复“T”为8个,而其他碱基重复数为5个。

DNA的完全硫化是很重要的,因此应选择含尽可能多的非甲基化CpG的“C”区域作为源序列,设计引物。对于BSP,引物设计的原则[1]:①为了区别甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不应含有CpG位点;②引物扩增的产物应包含尽可能多的CpG位点。

对于MSP需要设计2对引物,一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的DNA;另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的DNA。根据甲基化的DNA为模板的PCR扩增甲基化的DNA;根据非甲基化的DNA为模板的PCR扩增非甲基化的DNA。MSP引物设计的原则:①为了最大限度的区分甲基化与非甲基化,引物的3′端至少包含1个CpG位点,我们可以自己设定CpG的“C”距3′末端的最远距离。“MethPrimer”中默认值为3,即是在引物的最后3个碱基中,至少有1个是CpG的“C”。②引物序列中应包含尽可能多的CpG位点。

③甲基化引物和非甲基化引物序列3′端应处于相同的CpG位点。如果,2对引物不在相同的CpG位点退火, PCR结果就不能准确反映样本DNA甲基化的情况。但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的长度,在起始位点和长度上也可以不同。一般非甲基化引物比甲基

化引物长,因为受Tm值限制,由于非甲基化引物中的“C”转化成“T”,导致GC含量降低,从而引起Tm降低。④2套引物应有相近的Tm值,“MethPrimer”中默认2套引物Tm值相差不超过5℃,这种限制可使2个PCR反应在同一PCR仪中进行。

问题解决参考

/bbs/topic/9184927?keywords=MSP

引物设计步骤（以CLEC14A基因为例）：

1.找到目标基因的启动子区（promoter）序列

首先打开ensembl页面：/index.html

如图在搜索框第一个物种选择Human，基因填入要研究的基因名，点击Go

搜索结果页面第一条下面箭头所指处Regulation，点击它（这里面主要是基因调控区域的信息）

打开新的页面后，下拉至长长的表格，找到第一个promoter，长度在2000bp左右。

然后点击最右侧Show旁边的+，出现的就是启动子区的序列了

将序列信息复制，然后就可以进入下一步

2.MSP引物设计

打开MSP在线引物设计工具页面：/methprimer/或者他们新开发的 2.0页面/methprimer2/

进入后我们选择第一个就好

进入引物设计页面后，我们把上一步得到的启动子区序列复制进这个大框框里，然后勾选箭头标示的两个选框，没有其他特殊要求其他部分均按默认选项设置就好。然后点击submit。

新生成的页面中会有CpG岛的预测，后续如果还有其他引物要设计，可能需要这些信息。将页面继续下拉即出现设计好的引物啦

我们通常没有特殊要求选择第一对引物就可以。要注意MSP需要两对引物，分别针对被甲基化的基因序列和没有被甲基化的。将序列复制下来加入实验设计，done.

当然如果第一对引物不work，建议一次把多组引物都保存下来，以备不时之需。