月季花药培养(公开课)

P：高杆抗锈病（DDTT） × 矮秆不抗锈病 （ddtt）
↓ 杂交育种
F1：的基因型和表现Dd型Tt，高秆抗锈病
a
各种配子的种类 DT，Dt,dT, dt a
↓ 花药离体培养
符合要求的单倍体的基因型 DT，Dt,dT, dt
↓ 秋水仙素处理
良种的基因型表现型 ddTT矮秆锈病
1 可以明显缩短育种年限
选材是否成功是花药培养成功的关键
（三）影响花药培养的因素
（2）花药培养时期的选择： 合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素
①原因：因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产 生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只有某一个 时期对离体刺激敏感。
②花药时期选择： 单核靠边期。 一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一
3 通常每瓶接种花药 7-10个，温度控制在 25℃ 左 右，不需要光照。幼小植株形成后才 需要光照。
一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织 或释放出胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便 进一步分化出再生植株。如果花药开裂释放出胚状体，则一个 花药内就会产生大量幼小的植株，必须在花药开裂后尽快将幼 小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难 分开。
2N
有丝分裂
4个小孢子N 四分体时期
有丝分裂
1个小孢子N 单核居中期
单核靠边期N
单核花粉粒
精子（花粉或花粉细胞） 营养细胞核
双核花粉粒N×2
三核花粉粒N×3
（二）产生花粉植株的两种途径
1、体细胞胚（胚状体）：在组织培养过 程中，某些体细胞在形态上转变为与合子 发育成的胚非常相似的结构，其发育过程 亦与合子胚类似。
单倍体育种方法的主要优点是 2 后代为纯。合子
实例：松、杉、柏
（一） 被子植物的花粉发育 花药
花丝
（一）被子植物的花粉发育
雄蕊
花丝 花药：囊状结构，内有很多花粉
药隔：花药中部，由薄壁细胞构成，内有
花药
维管束（疏导组织） 表皮
花粉囊（4或2个） 纤维层
（3）花药的结构：
（4）被子植物的花粉发育
花粉的概念:由花粉母细胞经过减数分裂形成的 单倍体的生殖细胞.
焙花青-铬矾法(花粉细胞核染成蓝黑色)。
花药（在卡诺氏固定液中处理20min）→取出，置于载玻片上 →焙花青－铬矾溶液染色→盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细胞核 被染成蓝黑色）
（二）材料的消毒
1、花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡30秒 2、无菌水清洗
3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分
4、放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2～4分钟 （质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）
5、无菌水冲洗3～5次
花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态
（三）接种和培养
1 灭菌后花蕾，要在无菌条件 下除去萼片和花瓣， 并立即将花药接种到培养基上。
2 在剥离花药时，要尽量不损伤花药 （否则接种后， 容易从受伤部位产生二倍体愈伤组织），同时还要彻 底 去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或 胚状体的形成。
①经历时期： 四分体时期、单核期、双核期等阶段
②花粉发育过程：
②花粉发育过程：
小孢子母细胞（花粉母细胞） 减数分裂
4个小孢子（小孢子四分体时期）
4个单倍体细胞连在一起，进入单核期时（四分 体的4个单倍体细胞彼此分离，各自形成具有4 个单细胞核的花粉粒）
1个小孢子（单核居中期）：这时的细胞含有浓
厚的原生质，核位于细胞中央称为单核居中期
月季花药培养基配方：在1000mlMS培养基配方中添加 2,4—D(0.4mg)、KT(0.2mg)、IAA(4mg)；调节PH
至5.8 3、其他影响因素：
如亲本的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度 对诱导成功率都有影响。
月季花药培养时的花粉粒最好是（ C）
A、四分体时期
B、二核或三核花粉粒
C、单核期
胚状体发育途径 烟草花药培养
部分花药通过胚状体途径形成小植株
愈伤组织发育途径 水稻花药培养
接种在平板上的水稻花药
部分花药产生愈伤组织
愈伤组织转接种到再生培养基
愈伤组织分化形成再生植株
主要原因是 花粉管核和Leabharlann Baidu生殖核融合
造成的
鉴定和筛选：
常常会出现染色体倍性的变化
植物组织培养技术与花药培养技术的比较
花期早期时的花药比后期的更容易产生花粉植株。 一般月季的花药培养时间选在5月初到5月中旬，即月 季的初花期。
选材是否成功是花药培养成功的关键
花期：花期一般指在一个生长季内植株开花的时间 段。比如某些种类的月季，从5月初一直到11月都 连续开花。那么5月初就叫做该种月季的初花期或 花期早期。花期早期的花蕾营养状态及生理状态都 比较好，能提高花粉诱导成功率。
花中皇后月季又称“月月红”，自然花期5至11月， 开花连续不断 ，通常扦插就可以成活。
课题2 月季的花药培养
知识回顾
• 花药培养的原理（单倍体育种的过程？ ）
正常植株（2N）
花药离体培养（N） 单倍体植株（N）
植株（2N）
秋水仙素处理， 使染色体加倍
优点：1 明显缩短育种年限
2 后代植株都为纯合子。
实验操作
一、材料的选取 二、材料的消毒 三、接种和培养
（一）材料选取
1、从花药看： 月季的初花期 从花粉看： 单核期 从花蕾看： 完全未开放的
2、通过镜检来确定是否处于适宜的发育期。
方法：醋酸洋红法(将染色体染成红色)
花药（载玻片上）→1%的醋酸洋红1滴→用镊柄将花药捣碎， 盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）
1 离体培养的外植体为 体细胞。
2 有丝分裂的过程，染 色体数量不变。
1 花粉是生殖细胞，得 到的单倍体植株，弱小 且高度不育。 2秋水仙素处理，染色 体加倍，恢复正常的染 色体数，为纯种。
练习：小麦高杆（D）对矮杆（d）为显性，抗锈病（T）对不抗锈病（t）为 显性，现有高杆抗锈病和矮杆不抗病的两种纯合体，要获得矮杆抗锈病的良种， 可用杂交育种和单倍体育种法，步骤如下：
1个小孢子（单核靠边期）：随着细胞不断长大，细
胞核由中央移向细胞一侧称为单核靠边期
有丝分裂
生殖细 胞核
生殖 有丝 2个精子 细胞 分裂（基因型相同）
双核期
花粉管细胞核 生殖细胞核与 花粉管细胞核 基因型相同；
营养细胞
两个精子和一个营 养核的基因型相同
（一） 被子植物的花粉发育
减数分裂
细胞生长
小孢子母细胞 或花粉母细胞
（二）产生花粉植株的两种途径
2、产生花粉植株的两种途径：通过花药培养产生的花
粉植株（单倍体植株）一般有两种途径：一种是花粉通 过胚状体阶段发育为植株；另一种是花粉在诱导培养基 上先形成愈伤组织，再将愈伤组织诱导分化成植株。
①花药中脱分化 胚状体 分化 丛芽
的花粉
（花粉胚）
②花药中脱分化 愈伤 再分化 丛芽
侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最适合花药 培养的小孢子发育时期为单核靠边期。
③其它时期选择的缺点 选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破碎； 选择单核期之后的花药接种，花瓣松动，又给材料的 消毒困难，且难以挑选到单核期的花药。
④单核期花药的挑选：通常选择完全未开放的花蕾。盛开
的或略微开放的花，都不宜选作实验材料。
的花粉
组织
诱导 生根
移栽
两种途径之间无绝对界限，主要取决于培养基中激素 的种类及其浓度配比。
（三）影响花药培养的因素
诱导花粉植株能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素 影响，其中材料的选择与培养基的组成是主要影响因素。
1、材料的选择：
（1）选材
①不同植物的诱导成功率很不相同； ②同一种植物的生理状况对诱导成功率也有直接影响：
⑤选择完全未开放花蕾的原因：
可挑选到单核期的花 ,菌少、易消毒
旁栏思考：为什么花瓣松动会给消毒带来困难？
花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药给材料的消毒 带来困难。
2、培养基的组成：培养基的组成会影响脱分化与再分化
花药培养基可能因植物的不同而有所变化如 小麦中为N6 马铃薯、月季中为MS 油菜中为B5培养基
一、基础知识
（一）被子植物的花粉发育
1、 被子植物和裸子植物
（1）被子植物定义：凡是种子有果皮包被着，胚珠 有子房壁包被着的植物，就叫做被子植物（绿色开花 植物） 实例：玉米、大豆、梨、杏
（2）裸子植物定义：凡是胚珠裸露，外面没有子房 壁包被，种子外面没有果皮包被的植物称为裸子植物 （无真正意义上的花）