主要禽病的实验室检测方法及结果分析
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6
图1 平板凝集试验检测结果
（2）血凝（HA）和血凝抑制试验（HI ）
?基本原理：某些病毒（如 NDV ）能够凝集 特定种类动物的红细胞，此即红细胞凝集 现象。这种红细胞凝集现象可以被特异性 抗血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验。
?主要应用：新城疫（ ND） 禽流感（ AI） 产蛋下降综合症（ EDS ） 鸡传染性支气管炎（ IB）
25
二、实验室监测方案的制定
1、雏鸡母源抗体检查（1-3日龄）
（1）了解原产地的免疫种类
?了解原产地易发病种类及保护性水平 ?确定需根据当地情况加免的疫苗 ?根据抗体反应追踪是否有过感染
26
（2）了解母源抗体水平
?根据母源抗体水平及各种疫病母源抗体半衰 期合理确定疫苗首免时间
?了解雏鸡免疫保护能力，便于疫病诊断
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图2 血凝抑制试验检测结果
G. Cattoli （OIE）
（3）琼脂免疫扩散试验（AGP ）
?基本原理：可溶性抗原（毒素、病毒、细 菌裂解液）与相应抗体结合 , 在电解质存 在情况下，产生可见的沉淀物。
?主要应用：鸡马立克氏病病毒（ MDV ） 鸡痘病毒（ FPV ）
10
图3 琼脂扩散试验检测结果
沉淀试验
琼脂免疫扩散试验（AGP ）
中和试验
病毒中和试验（VN）
标记抗体技术 酶标记技术→酶联免疫吸附试验（ELISA ）
5
（1）平板凝集试验（ SPA ）
?基本原理：细菌、红细胞等颗粒状抗原与 相应抗血清在电解质存在情况下，产生可 见的颗粒凝集现象。
?主要应用：鸡白痢（ SP） 支原体（ MG/MS ）
15
? 主要应用：多种禽病检测 ? 抗体检测最常用 ELISA 方法：间接法，是利
用酶标记的抗抗体（一般为抗鸡 IgG ）检测 已与固相抗原结合的抗体。
16
底物显色 酶标二抗 待检抗体 包被抗原 固相载体
图6 间接ELISA方法测抗体的基本原理示意图
3、血清学检测应注意的问题
?考虑血清学检测的目的 ?血清样品的采集方法 ?采集血清样品的数量 ?血清样品的标记 ?血清样品的贮藏及运输
?高度特异性 ?反应可逆性 ?反应二阶段性 ?影响反应的因素
3
? 血清学反应的应用
?抗原抗体的快速检测 ?微生物的鉴定与分析 ?生物活性物质的超微定量 ?抗原抗体在细胞和亚细胞水平定位
4
2、血清学反应类型及常用试验方法
反应类型 常用试验名称
凝集试验
直接凝集试验→平板凝集试验（SPA） 血凝（HA）和血凝抑制试验（HI ）
32
（2）双份血清检测
?鉴于发病后抗体常有明显升高，双份血清抗 体值对比分析有很好的诊断价值。
33
（3）抗原检测
?某些情况下，抗原检测可以直接证实感染 状况的存在。
34
（4）未免疫鸡群抗体检测
?未免疫鸡群某疾病抗体的出现，特别注意雏 鸡母源抗体消失后抗体的再出现以及随日龄 增加而抗体持续上升的现象，这对疾病诊断 十分重要。
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（二）病原学检测方法
1、病原分离鉴定
（1）定义：指通过人工培养的方法分离出 病原体的过程。
19
（2）病原分离主要目的
?进行疾病诊断 ?疾病确诊的黄金方法 ?病原学研究的基础
20
（3）病原分离方法
?细菌分离培养：各种培养基 ?病毒分离鉴定：鸡胚、细胞或实验动物接种
21
（4）进行病毒分离应注意的问题
?样品采集时间 ?采集样品种类 ?样品贮藏及运输 ?常见接种途径 ?常用鉴定方法
22
2、聚合酶链式反应（PCR ）
（1）主要目的：通过对特异性基因片段的检 测达到检测病原体的目的。
（2）优缺点：方便快捷、存在假阳（阴）性
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图7 常规RT-PCR检测结果（电泳图）
3、其它病原学检测方法
（1）血凝（ HA）和血凝抑制（ HI ）试验 （2）琼脂免疫扩散试验（ AGP ） （3）酶联免疫吸附试验（ ELISA ） （4）胶体金试纸条检测 （5）动物实验检查
30
（4）重要节点检查
?30~50d 检查（检查前几次免疫效果） ?开产前检查（产蛋期及雏鸡保护性抗体需求） ?36~40W 检查（确定抗体水平、适时补免）
31
3、生产发生变动时的检查
（1）日常规律性抗体监测
?做为发病时检查的参考数据 ?做为鸡群抵抗力的依据，指示病因分析方向 ?做为流行病学分析数据，利于发现病原变异
主要禽病的实验室检测方法及 结果分析
张国中（中国农业大学） 2011年4月23日
一、常用的实验室检测方法
（一）血清学检测方法
1、免疫血清学技术
?抗原与抗体在体内（外）均可发生特异性 结合反应，因为抗体主要来自于血清，在 体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应 或免疫血清学技术。
2
? 血清学反应的一般特点
35
4、重要疫病流行动态分析
? 流行动态分析对生产企业来说，开展具有一定 的难度，但对重要疫病，尤其是重点进行免疫 防控的疫病仍然值得重视，对长期的流行资料 进行分析，会得到极为有益的技术支持。
36
? 流行动态分析需要进行大量工作，除抗体监测外， 必需配合针对性的实验室研究工作，如病原分离 鉴定、动物实验和必要的分子生物学研究。
27
2、免疫检查
（1）Leabharlann Baidu疫前检查
?目的是了解免前抗体水平、决定免疫时间和 进行免疫效果评价。
? 初免前检查 ? 再免前检查
28
（2）免疫后检查
?目的是检查免疫效果，评价免疫成功或失 败，尽快采取相应措施确保生产安全。通 常应选择免疫后 14-21天进行。
29
（3）定期检查
?目的是规律性检查抗体消长水平以便及时 采取补救措施，分析各种免疫之间的相关 性，调整免疫程序。
空白对照 病毒接种 病毒+抗血清 图5 采用中和试验对疑似 IBV分离物进行鉴定与分型
（5）酶联免疫吸附试验（ELISA）
?基本原理：抗原抗体反应的特异性 酶促反应的高效性
?使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面并 保持其免疫活性；
?使抗原（或抗体）与某种酶连接成酶标物，这 种酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又 保留酶的活性。
1. 抗原；2. 阳性对照；3-6. 待检血清；7. 阴性对照
（4）病毒中和试验（VN）
?基本原理：抗原与相应的抗血清按适当比 例混合作用后，可被中和而失去感染实验 动物、组织细胞或鸡胚的能力。
?主要应用：鸡传染性支气管炎病毒（ IBV ） 的血清分型。
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空白对照
病毒接种
图4 采用鸡胚接种进行 IBV分离
图1 平板凝集试验检测结果
（2）血凝（HA）和血凝抑制试验（HI ）
?基本原理：某些病毒（如 NDV ）能够凝集 特定种类动物的红细胞，此即红细胞凝集 现象。这种红细胞凝集现象可以被特异性 抗血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验。
?主要应用：新城疫（ ND） 禽流感（ AI） 产蛋下降综合症（ EDS ） 鸡传染性支气管炎（ IB）
25
二、实验室监测方案的制定
1、雏鸡母源抗体检查（1-3日龄）
（1）了解原产地的免疫种类
?了解原产地易发病种类及保护性水平 ?确定需根据当地情况加免的疫苗 ?根据抗体反应追踪是否有过感染
26
（2）了解母源抗体水平
?根据母源抗体水平及各种疫病母源抗体半衰 期合理确定疫苗首免时间
?了解雏鸡免疫保护能力，便于疫病诊断
8
图2 血凝抑制试验检测结果
G. Cattoli （OIE）
（3）琼脂免疫扩散试验（AGP ）
?基本原理：可溶性抗原（毒素、病毒、细 菌裂解液）与相应抗体结合 , 在电解质存 在情况下，产生可见的沉淀物。
?主要应用：鸡马立克氏病病毒（ MDV ） 鸡痘病毒（ FPV ）
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图3 琼脂扩散试验检测结果
沉淀试验
琼脂免疫扩散试验（AGP ）
中和试验
病毒中和试验（VN）
标记抗体技术 酶标记技术→酶联免疫吸附试验（ELISA ）
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（1）平板凝集试验（ SPA ）
?基本原理：细菌、红细胞等颗粒状抗原与 相应抗血清在电解质存在情况下，产生可 见的颗粒凝集现象。
?主要应用：鸡白痢（ SP） 支原体（ MG/MS ）
15
? 主要应用：多种禽病检测 ? 抗体检测最常用 ELISA 方法：间接法，是利
用酶标记的抗抗体（一般为抗鸡 IgG ）检测 已与固相抗原结合的抗体。
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底物显色 酶标二抗 待检抗体 包被抗原 固相载体
图6 间接ELISA方法测抗体的基本原理示意图
3、血清学检测应注意的问题
?考虑血清学检测的目的 ?血清样品的采集方法 ?采集血清样品的数量 ?血清样品的标记 ?血清样品的贮藏及运输
?高度特异性 ?反应可逆性 ?反应二阶段性 ?影响反应的因素
3
? 血清学反应的应用
?抗原抗体的快速检测 ?微生物的鉴定与分析 ?生物活性物质的超微定量 ?抗原抗体在细胞和亚细胞水平定位
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2、血清学反应类型及常用试验方法
反应类型 常用试验名称
凝集试验
直接凝集试验→平板凝集试验（SPA） 血凝（HA）和血凝抑制试验（HI ）
32
（2）双份血清检测
?鉴于发病后抗体常有明显升高，双份血清抗 体值对比分析有很好的诊断价值。
33
（3）抗原检测
?某些情况下，抗原检测可以直接证实感染 状况的存在。
34
（4）未免疫鸡群抗体检测
?未免疫鸡群某疾病抗体的出现，特别注意雏 鸡母源抗体消失后抗体的再出现以及随日龄 增加而抗体持续上升的现象，这对疾病诊断 十分重要。
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（二）病原学检测方法
1、病原分离鉴定
（1）定义：指通过人工培养的方法分离出 病原体的过程。
19
（2）病原分离主要目的
?进行疾病诊断 ?疾病确诊的黄金方法 ?病原学研究的基础
20
（3）病原分离方法
?细菌分离培养：各种培养基 ?病毒分离鉴定：鸡胚、细胞或实验动物接种
21
（4）进行病毒分离应注意的问题
?样品采集时间 ?采集样品种类 ?样品贮藏及运输 ?常见接种途径 ?常用鉴定方法
22
2、聚合酶链式反应（PCR ）
（1）主要目的：通过对特异性基因片段的检 测达到检测病原体的目的。
（2）优缺点：方便快捷、存在假阳（阴）性
23
图7 常规RT-PCR检测结果（电泳图）
3、其它病原学检测方法
（1）血凝（ HA）和血凝抑制（ HI ）试验 （2）琼脂免疫扩散试验（ AGP ） （3）酶联免疫吸附试验（ ELISA ） （4）胶体金试纸条检测 （5）动物实验检查
30
（4）重要节点检查
?30~50d 检查（检查前几次免疫效果） ?开产前检查（产蛋期及雏鸡保护性抗体需求） ?36~40W 检查（确定抗体水平、适时补免）
31
3、生产发生变动时的检查
（1）日常规律性抗体监测
?做为发病时检查的参考数据 ?做为鸡群抵抗力的依据，指示病因分析方向 ?做为流行病学分析数据，利于发现病原变异
主要禽病的实验室检测方法及 结果分析
张国中（中国农业大学） 2011年4月23日
一、常用的实验室检测方法
（一）血清学检测方法
1、免疫血清学技术
?抗原与抗体在体内（外）均可发生特异性 结合反应，因为抗体主要来自于血清，在 体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应 或免疫血清学技术。
2
? 血清学反应的一般特点
35
4、重要疫病流行动态分析
? 流行动态分析对生产企业来说，开展具有一定 的难度，但对重要疫病，尤其是重点进行免疫 防控的疫病仍然值得重视，对长期的流行资料 进行分析，会得到极为有益的技术支持。
36
? 流行动态分析需要进行大量工作，除抗体监测外， 必需配合针对性的实验室研究工作，如病原分离 鉴定、动物实验和必要的分子生物学研究。
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2、免疫检查
（1）Leabharlann Baidu疫前检查
?目的是了解免前抗体水平、决定免疫时间和 进行免疫效果评价。
? 初免前检查 ? 再免前检查
28
（2）免疫后检查
?目的是检查免疫效果，评价免疫成功或失 败，尽快采取相应措施确保生产安全。通 常应选择免疫后 14-21天进行。
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（3）定期检查
?目的是规律性检查抗体消长水平以便及时 采取补救措施，分析各种免疫之间的相关 性，调整免疫程序。
空白对照 病毒接种 病毒+抗血清 图5 采用中和试验对疑似 IBV分离物进行鉴定与分型
（5）酶联免疫吸附试验（ELISA）
?基本原理：抗原抗体反应的特异性 酶促反应的高效性
?使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面并 保持其免疫活性；
?使抗原（或抗体）与某种酶连接成酶标物，这 种酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又 保留酶的活性。
1. 抗原；2. 阳性对照；3-6. 待检血清；7. 阴性对照
（4）病毒中和试验（VN）
?基本原理：抗原与相应的抗血清按适当比 例混合作用后，可被中和而失去感染实验 动物、组织细胞或鸡胚的能力。
?主要应用：鸡传染性支气管炎病毒（ IBV ） 的血清分型。
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空白对照
病毒接种
图4 采用鸡胚接种进行 IBV分离