发酵液预处理与固液分离

发酵液的预处理和固液分离方法综述

鲁彬彬1002011044

摘要：

从微生物发酵液或细胞培养液中提取生化物质的第一个重要步骤，就是预处理和固液分离。其目的不仅在于分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒，还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后续的各步操作。

关键字：

预处理固液分离

正文：

一、发酵液预处理

微生物发酵和细胞培养的目标产物主要有菌体、胞内产物和胞外产物三类物质。从发酵液和细胞培养液中提取所需的生化物质，第一步就需进行预处理，以便于固液分离，使代谢产物后续的分离纯化工序顺利进行。其原因有三个方面：首先，发酵液多为悬浮液，粘度大，为非牛顿型流体，不易过滤，而所需的生化物质往往只有分布在液相，才能有效地提纯。并且，在有些发酵液中，菌体自溶，核酸、蛋白质及其他有机粘性物质这三类物质会造成滤液混浊、滤速极慢，必须设法增大悬浮物的颗粒直径，提高沉降速度，以利于过滤；其次，目标产物在发酵液中的浓度通常较低；此外，发酵液的成分复杂，大量的菌丝体、菌种代谢物和剩余培养基会对提取造成很大的影响。所以，对发酵液进行适当的预处理，从而分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒（如细胞碎片、核酸以及蛋白质的沉淀物），并除去部分可溶性杂质和改变发酵液的过滤性能，是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤。

预处理方法要根据发酵产品、所用菌种和发酵液特性来选择。大多数发酵产品存于发酵液中，少数存于菌体中，而发酵液和菌体中都有产物存在的情形也比较常见。如果目的产物是胞外产物，则通过离心或过滤实现固液分离，使其转入液相；而对于胞内产物而言，收集细胞是预处理的首要一步。细胞经破碎或整体细胞萃取使目的产物释放，转入液相，再进行细胞碎片的分离。如果所需的产物为细胞，离心或过滤所得固相经干燥等过程就可得到菌体。图1－1为生化产品分离纯化的一般步骤，图中虚线以上为预处理过程示意图。

图1－1 生化产品分离纯化的一般步骤【1】

1.1 预处理简述

发酵液经过预处理，一些物理性质会改变，从悬浮液中分离固形物的速度随之提高，过滤操作更易进行；在预处理过程中，产物大多转移进入易于后处理的相中（一般为液相）。同时，发酵液中的部分杂质也得以去除。

发酵液的预处理过程一般包括以下几部分：

（1）发酵液杂质的去除：包括除去蛋白质、无机离子以及色素、热原质、毒性物质等有机物质。

（2）改善培养液的处理性能：主要通过降低发酵液的粘度，调节适宜的pH 值和温度[1]及絮凝与凝聚等操作来实现。

预处理在生物技术产品的加工和提纯过程中相当重要。目的产物不同，采用的预处理方法也不同。并且，由于具体发酵液的实际情况差别很大，预处理方法

就更加灵活，多样，应根据生产需要进行选择和改进。

发酵液预处理之后，再进行固液分离，进入后续的分离纯化工艺。

1.2 发酵液杂质的去除

发酵液成分复杂，目的产品与许多溶解的和悬浮的杂质夹杂在一起。在这些杂质中对提取影响最大的是高价无机离子和杂蛋白。在采用离子交换法提炼时，高价无机离子，尤其是Ca2+ 、Mg2+ 、Fe3+的存在，会影响树脂对生化物质的交换容量。而杂蛋白，一方面，在采用离子交换法和大网格树脂吸附法提炼时会降低吸附能力，另一方面，在采用有机溶剂或两水相萃取时，常有乳化现象，使两相分离不清。除此之外，在常规过滤或膜过滤时，杂蛋白还会使滤速下降，污染滤膜。因此，在预处理时，应尽量除去这些杂质。【2】

1.2.1 无机离子的去除

由于培养基或水中含有无机盐，发酵液中往往存在许多无机离子，如Mg2+、Ca2+等，因而需要经常测定并除去无机离子。去除的方法比较固定，因此，在这方面的研究也比较少。

1.2.2 可溶性蛋白质的去除及其生化机理

在发酵液中除了上述高价无机离子外，还存在可溶性杂蛋白。一般来讲，对于无机或有机酸、碱及其金属盐类，在特定条件下，通过溶媒转向、离子交换等方法可使其与产物逐步分离。但对于可溶性杂蛋白，如果任其进入滤液，将给以后各步的分离精制工作带来极大的不便。因此发酵液的预处理，从根本上说，是如何使可溶性杂蛋白形成沉淀，以便随固形物一同除去的过程。在各种方法中，变性沉淀最为常用。正确认识蛋白质的性质和变性理论很重要，因为它是发酵液预处理所依据的生化机理[3]。

1.3有色物质的去除

在发酵的过程中，培养基本身可能带入色素，如糖蜜、玉米浸出液等都带有颜色，使得发酵液的颜色加深；此外，微生物在代谢过程中，本身也可能产生有色物质。但是，从提高产物的质量的观点来看，又必须除去发酵液中有色物质【3】。

色素的化学结构比较复杂，性质多样，给脱色工作带来了相当大的麻烦。常用的脱色方法为吸附法，如活性炭吸附，树脂吸附等。吸附法可以不用或少用有

机溶剂，操作简便，设备简单，生产过程中的pH值变化范围小。陈碧娥等人采用K－15颗粒活性炭作脱色剂对L－乳酸发酵液进行脱色，脱色率达到97%，而乳酸钙的损耗仅为1%左右。常用于吸附的树脂又称为“脱色树脂”，它表面积大，具有多孔性，吸附能力强等特点。在发酵工业中多用于脱色、吸附大分子的产物和除去蛋白质。近年来出现的大网格树脂孔隙大，树脂内表面积大，也可应用于脱色工艺。例如食品工业上的糖浆脱色时多用大网格树脂。此外，脱色工艺还可以利用某些离子交换树脂进行。例如，采用强碱性阴离子交换树脂，使果胶酶溶液脱色，酶活损失率不超过15%～20%。阴离子交换树脂对糖浆中的有色物质具有很强的吸附能力，可以用在谷氨酸发酵液的脱色中，树脂的最佳操作形式为磷酸盐式。用DEAE－纤维素从含酶溶剂中吸附有色物质，通常可同时除去非活性蛋白质，使主产物纯化2～5倍。

另外，现在的预处理工艺也采用工业酶制剂完成，如净化发酵产物、除去干扰性浑浊物。用淀粉酶将发酵液中残留的不溶性多糖转为单糖，可以提高过滤速度；用带电胶体如鱼胶添加到浑浊的饮料中以除去悬浮体等等。

2.1.液处理性能的改善

2.1.1降低发酵液的粘度

根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，因此降低液体粘度可以有效的提高过滤速率。降低液体粘度的常用方法有加热法和加水稀释法两种。

升高发酵液的温度可以有效的降低液体粘度，提高过滤速率。同时，在合适的温度和受热时间下，蛋白质会凝聚，形成大颗粒的凝聚物，发酵液的过滤特性得到了进一步的改善。但是，生物产品往往对温度敏感，因此，加热时必须严格的控制加热温度和加热时间。首先，加热温度必须低于目的产物的变性温度：其次，温度过高或时间过长，细胞溶解，会使胞外物质外溢，反而增加了发酵液的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。例如，在40℃时，12°Be′麦芽汁的粘度为1.2×10-3Pa·s，当温度升至75℃时，粘度可下降一半，过滤速率加倍。对于链霉素的发酵液，在pH值3.0的条件下，升温至70℃后维持半小时，可使液体粘度下降1/6，过滤速率增大10～100倍。

加水稀释法也是降低发酵液粘度的方法。但是，稀释后悬浮液的体积增大，加大了后续过程的处理任务。针对过滤操作而言，稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比，才能认为有效，即若加水一倍，稀释后液体粘度应下降一半以上，过滤速率才能得到有效提高。

2.2.2 调节pH值

调节pH值是发酵液预处理的常用方法之一。因为pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，通过调节pH值可以改善其过滤特性。首先，对于氨基酸和蛋白质等两性物质而言，将pH值调至等电点，即可沉淀除去。其次，在膜过滤时，发酵液中的大分子物质容易吸附于膜上，调节发酵液的pH值可改