实验流程.ppt

2.5
2.5 mM dNTPs (dATP、dCTP、dGTP、dTTP)
2
5’端引子(F) 10 μM
1
3’端引子(R) 10 μM
1
DNA模板
2
Taq DNA 聚合酶
0.5
總體積(μl)
25
聚合酶連鎖反應PCR 膠體電泳分析
1.聚合酶連鎖反應
目的： 含特定基因的1小段DNA
多次複製
大量增加
2.膠體電泳分析 目的：
聚合酶連鎖反應PCR 膠體電泳分析
1.聚合酶連鎖反應
目的： 含特定基因的1小段DNA
多次複製
大量增加
2.膠體電泳分析 目的：
以洋菜膠體電泳法將DNA片段依分子量大小予以 分離
實驗流程 ：
PCR反應配製
上PCR機器
DNA膠體電泳
照相顯影
DNA膠體電泳
DNA含有磷酸根，在中性及鹼性環境下帶負電，通電後會往 正極移動。洋菜膠體內有許多孔隙，濃度越高，孔隙越小。 在電場中，不同大小的DNA片段，在洋菜膠體的孔隙內往正 極移動，DNA分子量大者，移動時所受的阻力越大，使其移 動較慢，在膠體上方；而分子量小者，則移動較快。因此藉 由洋菜膠體電泳的過程可將不同大小的DNA分開
聚合酶連鎖反應PCR 膠體電泳分析
1.聚合酶連鎖反應
目的： 含特定基因的1小段DNA
多次複製
大量增加
2.膠體電泳分析 目的：
以洋菜膠體電泳法將DNA片段依分子量大小予以 分離
實驗流程 ：
PCR反應配製
上PCR機器
DNA膠體電泳
照相顯影
DNA膠體電泳
DNA含有磷酸根，在中性及鹼性環境下帶負電，通電後會往 正極移動。洋菜膠體內有許多孔隙，濃度越高，孔隙越小。 在電場中，不同大小的DNA片段，在洋菜膠體的孔隙內往正 極移動，DNA分子量大者，移動時所受的阻力越大，使其移 動較慢，在膠體上方；而分子量小者，則移動較快。因此藉 由洋菜膠體電泳的過程可將不同大小的DNA分開
分子量大
分子量小
聚合酶連鎖反應PCR 膠體電泳分析
1.聚合酶連鎖反應
目的： 含特定基因的1小段DNA
多次複製
大量增加
2.膠體電泳分析 目的：
以洋菜膠體電泳法將DNA片段依分子量大小予以 分離
實驗流程 ：
PCR反應配製
上PCR機器
ห้องสมุดไป่ตู้
DNA膠體電泳
照相顯影
PCR反應配製
體積(μl)
dH2O
16
10Χ PCR buffer (KCl、Tris-HCl、MgCl2)
500 bp 200 bp
500~600 bp 病患 200~300 bp 正常
以洋菜膠體電泳法將DNA片段依分子量大小予以 分離
實驗流程 ：
PCR反應配製
上PCR機器
DNA膠體電泳
照相顯影
上PCR機器
PCR機器設定
第一步 第二步 第三步
溫度 時間 95 ℃ 5分
35個循環 95 ℃ 30秒 61 ℃ 30秒 72 ℃ 30秒 72 ℃ 10分
目的
加熱變性 引子黏合 DNA聚合
2 .SYBR
洋菜膠體
漢氏舞蹈症
SCA3基因
• 正常： CAG重複的數目為12-40(分子量小) • 病患： CAG重複的數目為56-86(分子量大) • 特徵：病患會有不自主性的動作發生
500 bp 200 bp
200~300 bp 病患 約100 bp 正常
漢氏舞蹈症
SCA3基因
• 正常： CAG重複的數目為12-40(分子量小) • 病患： CAG重複的數目為56-86(分子量大) • 特徵：病患會有不自主性的動作發生
聚合酶連鎖反應PCR 膠體電泳分析
1.聚合酶連鎖反應
目的： 含特定基因的1小段DNA
多次複製
大量增加
2.膠體電泳分析 目的：
以洋菜膠體電泳法將DNA片段依分子量大小予以 分離
實驗流程 ：
PCR反應配製
上PCR機器
DNA膠體電泳
照相顯影
聚合酶連鎖反應(PCR)
1.
目的： 含特定基因的1小段DNA 多次複製
第三步：DNA聚合(polymerization)
72℃ 30秒：產生新的一股DNA
聚合酶連鎖反應
30-40循環
1.加溫變性
95 ℃ 30秒 DNA模板
2.引子黏合
60 ℃ 30秒 5’端引子 3’端引子
3.DNA聚合
72 ℃ 30秒 dNTPs Taq酵素
PCR可以生產大量DNA
重覆上述步驟n次，DNA的量變為原來的2n倍
大量增加
2. 原理：
第一步：加熱至95℃ (打開DNA雙股)
第二步：冷卻至55 ℃ ~63℃ (引子黏合)
第三步：加熱至72 ℃
(DNA聚合)
重覆上述步驟n次，DNA的量變為原來 的2n倍
第一步：加溫變性(denature)
95℃ 30秒：打開雙股
第二步：引子黏合(annealing)
60℃ 30秒：引子配對黏合
聚合酶連鎖反應PCR 膠體電泳分析
1.聚合酶連鎖反應
目的： 含特定基因的1小段DNA
多次複製
大量增加
2.膠體電泳分析 目的：
以洋菜膠體電泳法將DNA片段依分子量大小予以 分離
實驗流程 ：
PCR反應配製
上PCR機器
DNA膠體電泳
照相顯影
照相顯影
原理： 染劑會鑲嵌在雙股中
染劑： 1 .溴化乙菲最常用 Ethidium Bromide (EtBr)