固定化酶制备及酶活力测定

实验三固定化酶制备及酶活力测定

【实验目的】

1.掌握包埋法固定化酶的操作技术。

2.掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。

3.学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。

【实验原理】

酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。

酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。

碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。

所谓固定化酶，就是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。将酶制成固定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。

酶的固定化方法大致可分为载体结合法、交联法和包埋法等。

载体结合法：将酶结合到非水溶性的载体上(图1)。一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。

①共价结合法是将酶蛋白分子上官能团和载体上的反应基团通过化学价键形成不

可逆的连接的方法。在温和的条件下能偶联的酶蛋白基团包括有氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等。常用的载体包括天然高分子（纤维素、琼脂糖、葡萄糖凝胶、胶原及其衍生物），合成高分子（聚酰胺、聚丙烯酰胺、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等）和无机支持物（多孔玻璃、金属氧化物等）。

共价结合法制备的固定化酶,酶和载体的连接键结合牢固,使用寿命长，但制备过程中酶直接参与化学反应，常常引起酶蛋白质的结构发生变化，导致酶活力的下降，往往需要严格控制操作条件才能获得活力较高的固定化酶。

②离子结合法通过离子效应将酶固定到具有离子交换基团的非水溶性载体上的一

种方法。能引起离子结合的载体,除具有离子交换基团的多糖类外,象离子交换树脂（见离子交换剂）那样的合成高分子衍生物也可用作载体。离子结合法与共价结合法比较,操作简便,处理条件温和，可以得到较多高活性的固定化酶。但载体和酶的结合力不够牢固，易受缓冲液种类和pH的影响。

③物理吸附法将酶吸附到不溶于水的载体上而使酶固定化的方法。常使用的载体有

活性炭、氧化铝、高岭土、硅胶、多孔玻璃、羟基磷灰石等。物理吸附法操作简便、费用较省,可供选择的载体类型多,有的可以再生。但酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶容易从载体上脱落，酶的非专一性吸附会引起酶的部分或全部失去。

交联法：利用双官能团或多官能团试剂与酶之间发生分子交联来把酶固定化的方法（图2）。常用的试剂有戊二醛、亚乙基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯- 马来酸酐共聚物等。参与此反应的酶蛋白中的官能团有N末端的α-氨基、赖氨酸的ε-氨基、酪氨酸的酚基和半胱氨酸的巯基等。交联法反应比较激烈，固定化酶的活力，在多数情况下都较脆弱。

包埋法：将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化（图3）。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。将酶包埋在聚合物内是一种反应条件温和，很少改变酶蛋白结构的固定化方法，此法对大多数酶、粗酶制剂、甚至完整的微生物细胞都适用。但此法较适合于小分子底物和产物的反应，因为在凝胶网格和微囊中存在有分子扩散效应。加大凝胶网格，有利于分子扩散，但使凝胶的机械强度降低。

【实验材料】

1. 试剂

（1）海藻酸钠、3.0％氯化钙；

（2）碱性蛋白酶：精确称取干酶粉1克，加入10 mL pH 10缓冲溶液，在小烧杯中溶解，并用玻璃棒搅拌，静止片刻后，将上层液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复搅拌溶解4次，最后全部移入100mL容量瓶中。用缓冲溶液定容至刻度，充分摇匀，用二层纱布或四层纱布过滤，吸取滤液10 mL，移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，所得液为稀释1000倍的酶液（1.0 mg /mL）。

（3）福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、125g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、350mL蒸馏水、25 mL 85％磷酸及50mL浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加25g硫酸锂、25 mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500 mL。过滤，置于棕色瓶中暗处保存。

使用前加4倍蒸馏水稀释。

（4）1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2 mol/L NaOH 4mL，充分研磨，用蒸馏水洗入100 mL容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100mL，保存于冰箱内。

（5）p H 10缓冲溶液：

甲液（0.05 mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克，用蒸馏水溶解并定容至1000 mL。

乙液：0.2 mol/L氢氧化钠溶液。

配制pH 10硼砂氢氧化钠溶液：吸取甲液50 mL，再加入乙液21mL，用蒸馏水定容至200 mL。

（6）标准酪氨酸溶液：精确称取酪氨酸50mg，加入1mL 1mol/L盐酸溶解后用蒸馏水定容至50 mL，即得1 mg/mL酪氨酸标准溶液。

（7）0.4 mol/L碳酸钠溶液，0.4 mol/L三氯醋酸溶液。

2. 仪器

磁力搅拌器、恒温水浴锅、、注射器、烧杯（100 mL，500 mL）、布式漏斗、分析天平、容量瓶、移液管、721分光光度计；