DEAE纤维素离子交换层析法分离血清蛋白

膨润 转型
DEAE-纤维素 6g 0.5M HCl 50 ml 混匀后静置30分钟 充分洗涤至 PH≥4
0.5M NaOH 50 ml 混匀后静置30分钟 充分洗涤至 PH≤8
H+
DEAE（二乙基氨基乙基）
+ + + H H H 在H+的攻击下产生SP2杂 化，从而形成带有正电荷 的基团
H+ H+ H+ H+
实验操作
三、加样
• 当液面接近纤维素顶上界面（注意：一定 不要干柱），关闭恒流泵。用吸量管小心
在层析管内接近纤维素层处缓慢加入血清 0.5mL（注意不要搅拌纤维素界面）。
• 打开恒流泵，使液体缓慢流出（5-10滴／ 分钟），到全部血清刚好流入纤维素层界 面，立即再用滴管小心加入1mL 0.01mol/L Na2HPO4液，直到液面接近纤维素层界面 时，关闭恒流泵。
H+ H+ H+ H+
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平衡 0.01 M Na2HPO4 100 ml 反复平衡至 PH = 8
• 在紫外检测仪的出口端放一只烧杯接流出 液。
装柱
层析柱下口旋紧、层析柱上口打开
封闭良好、防漏
从上口倒入液体
起始洗脱液，排气、查漏
上口倒入纤维素
已平衡好的纤维素
纤维素沉降完全
纤维素1/2~2/3高度 保留弯月形液体界面
流出管口封闭
装柱注意事项
• 将处理好的纤维素悬液倾入层析柱内 （注 意不要带入气泡，如混悬液过浓，可增加 适量Na2HPO4液）
[实验原理] 层析的基本原理及分类 离子交换层析法 本实验的分离原理
如溶解度、吸层附 析
能力、分子形状 和大小、分子极
性等
是利用混合物中各组分的物理化
学性质的差别，使各组分在两个相中
的分布不同，而使各组分可以不同速
度随流动相向前移动而达到分离的目
的．
固定相 流动相
固定相：固定相是层析的一个基质。
生物化学实验
DEAE纤维素离子交换层析法 分离血清蛋白
指导教师：曹文华
[实验目的]
1.掌握DEAE-纤维素离子交换层析法 分离血清蛋白质的实验原理及过程。
（参见教材P94-95实验十六）
2.熟悉层析技术的相关原理。 （参见教材P12-23：包括层析技术的概念、分
类及分离原理。离子交换层析法的基本原理、 介质种类、洗脱方式等。整套层析设备的组 成及使用等）
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OOHH---
OH -
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O-H
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O-H
OH
OH -
O-H
OH
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OH
膨润的作用
• 1、使层析介质形成其特定 功能基团
• 2、加大纤维素之间的距离， 以利于蛋白质的通过
• 3、清除杂质
转型或再生的作用
• 1、用置换能力强、浓度高 的离子将层析介质所结合 的离子置换下来
各血浆蛋白质的等电点
分类 清蛋白
1-球蛋白 2-球蛋白
-球蛋白
-球蛋白
pI
pH8.0
4.64
—
5.06
—
5.06
—
5.12
—
6.85-7.3 —
组成比例
56一62％ 4一7％ 9一11％ 11一15％ 12一16%
[实验操作] 纤维素的处理 仪器连接与装柱 上样与洗脱
实验操作
一、纤维素的处理
柱层析 薄层层析 纸层析
离子交换层析法
• 是分析性和制备性的分离、纯化混合物的液-
固相层析方法。 • 它基于所研究或所分离物质的阳或阴离子和
相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据 物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸 附和脱吸附而将溶液的各组分分开。 • 固定相就是离子交换剂，流动相是具有一定 pH值和离子强度的电解质溶液。
固体物质：如吸附剂，凝胶，离子交换剂等 液体物质：如固定在硅胶或纤维素上的溶液 这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附， 溶解，交换等作用。
流动相：推动固定相上待分离的物质朝着一个 方向移动的液体、气体等。
柱层析 ---- 洗脱剂 薄层层析 ---- 展层剂
introduction
mobile phase
Stationary phase
A representation of the principles of chromatography
层析分类
根据两相所处状态
气相(气-液;气-固)层析 液相(液-液;液-固)层析
根据层析分离机制
吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析
根据操作形式不同
• 打开恒流泵，使液体流出，控制流速为3-6 秒1滴。直到全部纤维素都放入柱内（或柱 中纤维素沉积至一定高度）
• 注意：一定不要干柱
装柱后期
• 再次检查整套层析设备是否正确连接 • 调好检测零点及流速：以0.01mol/L
Na2HPO4为标准调基线（吸光度A为5%， 透光率T为95%）；流速为5-10滴每分钟(612秒1滴)。 • 记录仪：摘下笔帽，笔落下，启动，测量 状态，走纸速度为6cm/h, 量程为100mV
• 2、清除杂质
平衡的作用
• 1、用交换能力弱的离子取 代交换能力强的离子，有 利于蛋白质的置换并防止 蛋白质的变性
• 2、设定起始的离子强度和 PH值
实验操作
二、仪器的连接与装柱
装柱前注意事项
• 一定要检查柱子两端是否流通，确保柱子 不堵。
•wk.baidu.com然后组装好层析柱，并连接好恒流泵、紫 外检测仪、及记录仪。
离子交换剂：是一类含有可解离基团的不溶性的高 分子化合物。
根据交换剂的结构不同，分为 离子交换树脂
分类 离子交换纤维素 离子交换葡聚糖和离子交换琼脂凝胶
根据交换剂的性能不同，分为 阳离子交换剂 阴离子交换剂
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本实验分离原理
本实验是用离子交换层析的分离原理，将血 清蛋白质（白蛋白PI=4.88(4.7-4.9); α1球蛋 白PI=α1球蛋白PI = 5.06; β球蛋白PI=5.12; γ球蛋白PI=6.85-7.50 ）在pH为8的条件下 交换到装在柱子中的DEAE纤维素离子交换 剂（阴离子交换剂）上后，应用梯度洗脱 法，逐渐改变pH与离子强度，将血清中各 种蛋白质组成成分逐步洗脱下来，从而达 到分离提纯的目的。
上样
加入血清 0.5 ml