第五章酶与细胞固定化技术

第五章酶与细胞的固定化技术

教学目的：使学生了解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）的概念及意义，掌握酶的常用固定化技术，了解固定化酶的性质。

教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）的范畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）的范畴,半透膜包埋法。

教学方法：讲授

教学手段：多媒体

第一节概述

一、游离酶使用中的局限性:

1.提取纯化繁琐,价格昂贵

2.难以重复使用

3.稳定性差

二、固定化酶研究

克服游离酶缺点的方法之一

50年代开始

60年代后期，固定化技术迅速发展

1969年，千田一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA连续生产L-AA实现酶应用史上的一大变革

三、基本概念

1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议）

（Immobilized Enzyme)

指在一定空间范围内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。包括酶与不溶性载体结合的“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中的酶。

2、固定化细胞（原生质体）

指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间范围内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。

四、固定化酶优点

增加了酶的稳定性

能降低酶的总体费用

酶的分离和回收变得容易，并可重复使用

使反应过程的连续操作成为可能

反应产物也易于提取纯化

有利于过程设计和优化

拓广了酶的应用范围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等）

第二节、酶的固定化方法

一、酶的固定化方法

1、酶的固定化方法（四大类方法）

1）吸附法

2）包埋法

3）交联法

4）化学共价法

其它（酶的逆胶束包囊法）

一、酶的固定化方法

2、选择方法依据：

⑴酶的性质

⑵载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等

⑶制备方法简便易行

⒊衡量依据：

⑴测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率；

⑵研究它的最适反应条件（底物浓度、pH 值、温度、离子强度等）；

⑶稳定性和不稳定原因的探究；

⑷对酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到较为理想的构型和相容性。

（一）吸附法

1、原理：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（范德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，常用的吸附剂有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。

此外还可利用专一的亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球蛋白Ａ与ａ一甘露聚糖具有亲和力，而酿酒酵母细胞壁上含有ａ一甘露聚糖，故可将伴刀豆球蛋白Ａ先连接到载体上，然后把酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白上。

2、酶材料：酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上的酶或酶系。

3、优缺点：操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体廉价易得，且可反复利用；

缺点是蛋白质与载体之间的结合相当弱,而且很多情况下,酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活,高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附.因此当要求酶的固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不可靠的.

4、常用吸附剂

各种矿物质以及无机载体(氧化铝，氧化铁，氧化钛，硅藻土，多空陶瓷，多空玻璃，羟基磷灰石等)，及天然高分子载体淀粉、白蛋白等，最常用的吸附剂是离子交换剂羧甲基纤维素，DEAE----纤维素、DEAE----葡萄糖，合成的阴离子和阳离子交换剂离子交换剂主要靠静电吸引，缺点是当离子强度增加或介质的pH、温度变化时，这种结合发生分解。

5、举例：

将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4 含0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）与酶液(10mg/ml) 5ml,在4℃，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物，用10mM NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于10ml NaAc PBS中备用。

（二）包埋法

1、概念：指将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中，使酶固定的方法。可分为凝胶包埋

法（网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种。

2、优缺点：一般不需酶的AA残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高；

缺点是包埋时发生化学聚合反应，酶易失活，须巧妙设计反应条件。另外网格结构影响底物和产物的扩散，有时，这种扩散会导致酶动力学行为的改变，所以此法只适合于小分子底物和产物的酶。

3、海藻酸盐包埋法

海藻酸钠与Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间的转移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒

缺点:

在高浓度电介质（K+,Na+）溶液中,固定化颗粒变得不稳定.

Ca2+等多价离子在磷酸缓冲溶液中易形成沉淀,固定化颗粒溶解

优点:

海藻酸盐价格便宜

包埋条件温和

4、角叉菜糖包埋法

K-角叉菜是一种含有许多硫酸根基团的多糖化合物.在K+离子存在下，它能立即生成凝胶.

缺点:

对高浓度的Na+离子敏感

固定化温度高,需要在37℃~55℃

5、聚丙烯酰胺凝胶

在含酶(或细胞)的水溶液中，加入一定比例的单体丙烯酰胺和胶联剂N,N’-甲撑双丙烯酰胺.然后在催化剂(二甲氨基丙腈)和引发剂(过硫酸钾)的作用下低温(冰浴)聚合,形成凝胶

缺点:

丙烯酰胺对酶具有变性作用

6、聚乙烯醇（PVA）包埋法

磷酸盐硬化法,循环冷冻法,硼酸硬化法

硼酸硬化法:

将聚乙烯醇在70℃~ 80℃进行水浴加热至完全溶解,然后冷却至35℃,与酶溶液(细胞悬浮液)混匀,滴加到饱和硼酸溶液中