噬菌体

噬菌体展示技术的发展和应用

2013级食品科硕班姜晓坤 21313033

摘要：噬菌体展示技术是一项筛选技术，是将外源蛋白质或多肽的基因序列与噬菌体衣的壳蛋白基因融合，并在细胞表面表达展示的基因工程技术。其将表达型与其基因型联系在一起，能提供高效率的筛选系统。该技术目前已被广泛应用于生命科学的许多领域，如蛋白质相互作用、抗体和疫苗的研制、医学诊断和治疗、酶制剂研制、多肽药物的开发等，并在众多基础和应用研究领域产生深远的影响，显示出巨大的应用潜力，应用前景十分广泛。

关键字：噬菌体展示技术，基因工程技术，蛋白质相互作用，应用领域

The development and application of phage display technology

Abstract:The phage display technology is a screening technique.It is a genetic engineering technique that combines the gene sequence of exogenous protein or polypeptide with the specific gene of surface protein of the phage to express on the surface of recipient cell and it can screen the specific proteins or antibodies efficiently. This technique has unique advantages and great potentials in the many fields such as developments of antibodies,vaccine,drugs and enzymic preparations, medical diagnosis and treatment and research of protein interaction.

Keyword: Phage display technology, Genetic engineering technique, Protein interactions, Applications

微生物表面展示技术是利用基因工程手段把靶蛋白(外源肽段或蛋白质结构域)基因序列与特定的载体蛋白基因序列(又叫定位序列)融合并在微生物细胞表面表达展示的新型基因工程技术，被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性。其重要特征和优点是靶蛋白与其编码DNA处于同一个病毒或细胞中，可以通过序列测定确定DNA序列并进一步推导外源蛋白氨基酸组成，从而实现了基因型和表现型的统一。其中靶蛋白序列与载体蛋白序列的融合方式主要有N端融合、C端融合和插入融合[1]。噬菌体、细菌、杆状病毒、酵母菌等多种微生物均可运用于该展示技术[1]。

噬菌体表面展示技术是微生物表面展示技术中应用非常广泛的，该展示技术是最早发展起来的，历经20多年发展。其基本概念是将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合，并在其表面展示，同时将其遗传密码信息整合到个体噬菌体的基因组中[2]。

1.噬菌体展示技术介绍

1.1. 噬菌体

噬菌体(bacteriophage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体，因其是以细菌为宿主的一类病毒，又称为细菌病毒。其广泛存在于自然界中，在绝大多数原核生物中都发现了相应的噬菌体。噬菌体是由F.W.Twort(1915年)和F.d.Herlle(1917年)分别发现的[3]。

噬菌体主要由蛋白质外壳和核酸组成，其基因组含有许多个基因，但所有已知的噬菌体都是细菌细胞中利用细菌的核糖体、蛋白质合成时所需的各种因子、各种氨基酸和能量产生系统来实现其自身的生长和增殖。一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。

1.2. 噬菌体展示技术原理

噬菌体展示技术是将外源DNA通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上，使外源DNA片段对应的表达产物形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对独立的空间结构和生物活性。然后利用靶分子，采用适当的淘洗①方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体[4]。

2.噬菌体展示系统分类

目前，最常用的噬菌体表面展示系统主要有：单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统[1]。

2.1. 单链丝状噬菌体表面展示技术

单链丝状噬菌体M13、f1、fd 等是单链DNA病毒[5]。运用于表面展示技术最常见的是M13噬菌体，其利用了M13噬菌体独特的生命周期及其所表达的几个噬菌体蛋白质[6]。

M13在感染大肠杆菌后，新合成的单链噬菌体DNA在穿过内膜时被包装为成熟的噬菌体颗粒。成熟的噬菌体在穿过宿主细胞壁时并不引起宿主细胞的裂解，因此M13噬菌体可被不断地产生，直到对细胞有害的产物大量积累以及细胞本身的废物累积过多而引起细胞死亡为止[6]。

M13不引起细胞裂解是其不同与其他噬菌体的特点。M13噬菌体只能融合较小的外源肽段，携带肽段太大会影响外壳的组装，使其失去感染力。但它的拷贝数多，因此该系统一般用于筛选亲和力较低的配体，其在疫苗开发上具有潜在的应用价值[7]。

2.2. λ噬菌体表面展示技术

λ噬菌体两端为不闭合的线形双链DNA[7]，其为是最早使用的克隆载体，此后它在分子克隆中始终起着重要的作用[6]。λ噬菌体展示系统是将外源肽或蛋白质与λ噬菌体的主要尾部蛋白PV或λ噬菌体头部组装的必需蛋白-D蛋白融合而被展示[8]。

λ噬菌体基因组在溶源性②生长过程中，通过位点专一重组整合入宿主DNA分子中，随宿主细胞DNA复制并转入子代。与丝状噬菌体相比，λ噬菌体是不必通过分泌途径，而是在宿主细胞内组装，可展示有活性的大分子蛋白(100 ku以上蛋白)及对宿主细胞有毒性的蛋白[7]，因此它可展示的肽或蛋白质范围较广[6]。

2.3. T4噬菌体表面展示技术

T4噬菌体的基因组为双链DNA[6]。T4噬菌体展示系统是将外源肽或蛋白质与T4噬菌体的小衣壳蛋白SOC的C端融合而被展示[9]。因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免因纯化引起的蛋白质变性和丢失，故T4可展示各种大小的多肽或蛋白质[5]，但由于其采用的是C端融合，这对研究蛋白质N端的功能不适合，而使它在蛋白质生物研究中的应用受到局限[7]。

①淘选:将展示文库作为流动相，而将与欲选择的重组基因产物有特异性亲和力的靶分子固定在固相载体上，洗去不能与固定相特异结合的组分，将特异结合的组分洗脱，再进一步扩增，进入下一轮淘选。如此反复淘选，即可将无用基因去掉而将有用的基因富集并分离。

②溶源性：温和噬菌体DNA具有整合入宿主菌染色质DNA中的特性，成为与宿主菌共生的原噬菌体，能随宿主菌的染色质同步复制而传给子代，这种特性称为溶源性。溶源菌受到某些条件的诱导(如紫外线照射等)，噬菌体DNA还可以从宿主菌染色质DNA中切出，最终形成噬菌体颗粒而裂解宿主菌。