乙酰肝素酶研究

乙酰肝素酶研究进展乙酰肝素酶( heparanase, Hpa) 是近年发现的肿瘤重要功能酶, 是体内唯一能够降解糖氨聚糖中的硫酸乙酰肝素( heparan sulfat , HS) 链的内切糖苷酶,特异识别HS 侧链上的特异性位点, 可以在特定部位裂解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在各种蛋白聚糖中最具生物活性,它参与多级联细胞粘附反应过程,并与粘附分子、细胞因子、细胞间信号分子等相互作用,在影响细胞增殖、分化、迁移及形态等方面具有重要作用,在各种炎症损伤、缺血再灌注损伤、血栓形成及肿瘤转移等过程中具有重要功能。

( heparan sulfate protoglycan,HSPG) , 将HS 裂解为10~ 20 个糖单位大小的短糖链, 并释放结合在HS 上的生长因子。

乙酰肝素酶可促进细胞的浸润和转移, 还可以促进肿瘤细胞分裂、趋化、微血管形成。

是目前在哺乳动物中发现的唯一一个可以剪切HSPGs 上HS 侧链的水解酶, 是抗肿瘤的理想靶点。

细胞发生侵袭转移首先要穿越由细胞外基质和基底膜组成的屏障。

该屏障主要有两种成分构成:一是结构蛋白, 包括胶原、层黏素、纤维结合素和玻璃体结合素等, 二是糖氨聚糖, 主要成分是HSPG,是广泛存在于脊椎动物组织细胞外基质( extracellular matrix, ECM) 和细胞表面的复杂的生物大分子,是构成基底膜的主要成分。

HSPG 主要由一个核心蛋白和数个与之共价连接的线性HS 侧链组成[ 1] ,HS 是由己糖醛酸和葡胺聚糖组成的重复单位构成。

HSPG 能与细胞表面及ECM 中的活性分子结合, 粘附于细胞表面, 是细胞外基质聚集和稳定的基础, 拥有限制细胞迁移、粘附和选择性分子筛的重要作用, 还可以与多种生物活性分子结合并相互作用。

事实上HSPG 的降解是细胞侵袭前所必需的, 当HSPG 被乙酰肝素酶降解后, 就会产生一系列生物学现象如妊娠形态发生、炎症反应、血管生成、肿瘤的侵袭和转移[ 2] 。

1 乙酰肝素酶分子特征1. 1 乙酰肝素酶的主要结构人类乙酰肝素酶基因约50kb, 定位于染色体4q 22, 与遗传标记D4S400 相连, 包括14 个外显子和13 个内含子[ 3] 。

通过不同的剪接, 此基因转录为5kb( HPSE1a) 和1. 7 kb ( HPSE1b ) 两种mRNA。

HPSE1a 含有14 个外显子和13 个内含子, 而在HPSE 1b 中第1 个和第14 个外显子被剪切掉了[ 4] 。

1b 和1a 含有相同的开放性阅读框, 均编码含有543个氨基酸的蛋白质。

Hpa cDNA 全长3 726 bp, 包含1 632 bp 开放读码框架, 乙酰肝素酶蛋白前体相对分子质量为65 @ 103 。

在乙酰肝素酶的分子结构中, 有6 个可能的糖基化位点。

糖链的作用可能是在蛋白转运过程和酶的分泌过程中承担动力学上的功能。

McKenzie 等研究报道了一个新的肝素酶亚型Hpa2, 其基因由乳腺dDNA 文库克隆而来, 定位于10q23~ 24 上, 与Hpal 之间有高度的同源性, 又分Hpa2a、Hpa2b、Hpa2c, 各自编码480、534、592 个氨基酸残基[ 5] 。

目前, 研究者认为, 很可能存在着一个乙酰肝素酶蛋白家族, 它们有着不同的底物特性和许多潜在功能。

HPa1 基因mRNA 在脾脏, 淋巴结, 胸腺, 外周血白细胞, 骨髓及胎盘等免疫组织中均可检测到, 而在胎盘之外的成熟非免疫组织中均不表达, 但在转移的恶性肿瘤细胞中普遍存在[ 6] 。

Hpa2 的cDNA主要在脑、乳腺、前列腺、睾丸和子宫中较高。

HPa2在胰腺癌中有较高表达, 而其在正常胰腺组织中几乎无表达, 由于Hpa1 与Hpa2 分布不同, 推测两者可能有不同的功能。

关于乙酰肝素酶的两种剪切形式Ia 和Ib 受什么因素控制, 特别是在肿瘤细胞中, 这种控制因素是否被修饰或升高, 从而造成1a 向1b 剪切转变是值得研究的课题。

2 乙酰肝素酶的定位及活性调节研究发现乙酰肝素酶主要定位于溶酶体, 乙酰肝素酶蛋白前体经翻译后最初表达在质膜, 与HSPGs 相互作用后, 被溶酶体摄入,经过溶酶体蛋白水解酶加工最终形成的有活性乙酰肝素酶。

多数学者认为, 在翻译后加工的过程中, N 端信号肽被切除, 形成乙酰肝素酶酶原前体, 在酶原激活的过程中, 特异性的蛋白水解酶将第110~ 157 位氨基酸组成的6 000 的肽链从前体蛋白中切割下来, 余下N 端的8 000 多肽链与C 端的50 000 蛋白非共价结合成异源二聚体, 成为有活性的成熟的蛋白。

大小两亚基之间的6 000 的连接片段的作用可能是通过封闭活性中心抑制了酶的活性。

Goldshmidt 等[ 7] 发现乙酰肝素酶定位于溶酶体和高尔基体, 故推测乙酰肝素酶合成后被转运至高尔基体, 随后以稳定的形式聚集于溶酶体。

溶酶体作为乙酰肝素酶在细胞内的场所,限制了它的分泌,一旦失控, 可能与肿瘤的转移、炎症细胞渗出、内皮细胞血管增生等恶性过程发生。

乙酰肝素酶的调控机制以及它的影响因素尚未明了,研究表明, 在正常生理条件下,肝素酶基因, 甚至酶蛋白本身也同样存在, 只是表达量较低, 或者酶活性极低。

2. 1 乙酰肝素酶基因表达调控乙酰肝素酶启动基因的去甲基化可以启动整个转录和翻译程序, 造成癌症发生、发展、转移等恶性表现。

Jiang 等[ 8] 和Lu 等[ 9] 的研究表明, Ets 启动子家族参与了肝素酶mRNA 在癌细胞中的表达。

Lu发现Ets1、Ets2 有顺式激活恶性乳腺癌细胞系肝素酶基因的功能。

Jiang 等强调Ets 成员之一GA 结合蛋白( GABP) 需要和Sp1 结合, 共同调控甲状腺肿瘤细胞系肝素酶转录。

应用反义寡核苷酸技术阻抑结肠癌细胞LS- 174T 中的eIF- 4E 基因表达, 结果显示乙酰肝素酶蛋白表达水平显著下降, 这表明eIF- 4E参与结肠癌细胞LS- 174T 中乙酰肝素酶的调控。

Mest re 等[ 10] 发现早期生长反应基因- 1 ( EGR1)能影响乙酰肝素酶的表达和活性, 且在不同类型肿瘤中上调或下调乙酰肝素酶的机制不同。

Og ishima 等[ 11] 用EGR1 siRNA 转染T24 膀胱癌细胞后与对照组相比明显下调乙酰肝素酶表达。

Ogishima等[ 12] 对髓母细胞瘤体外侵袭实验的研究表明, P75 神经营养因子受体( P75NT R) 和trk 受体家族成员( TrkC) 经由神经营养因子- 3( NT - 3) 激活后能增加乙酰肝素酶活性, 从而使细胞侵袭能力提高。

还有Shteper 等[ 13] 报告高糖可以通过增强启动子活性来调整HPa- 1 基因的表达。

2. 2 乙酰肝素酶生物活性调控乙酰肝素酶受pH 调控, 在pH 4. 0-7. 5 时, 表现有活性[ 14] 。

最佳内切糖苷酶活性是在pH 5. 5-5. 8 的之间, pH 值越高其活性越低; 炎症发生部位、血管闭锁引起缺血及肿瘤中心部位血管缺乏都将为乙酰肝素酶提供一个适宜的酸性环境, 使其发挥酶的最大降解活性。

如果pH 大于8. 0 就会失去活性, 但却拥有黏附作用。

失活的乙酰肝素酶和细胞外基质中的硫酸乙酰肝素结合, 被结合的肝素酶可以作为内切葡糖苷酸酶的储库, 以便炎症时能马上降解细胞外基质和血管基底膜, 便于白细胞向血管外和基质中游走。

因此, 局部组织的pH 能够调节乙酰肝素酶的活性及存在形式。

细胞表面的HSPG 还具备肝素酶活性调节剂的功能。

体外培养的细胞一定通过细胞表面的HSPG 将刚刚分泌的酶原迅速内吞活化成为具有活性的肝素酶, 而不是直接在胞内在蛋白水解酶的作用下活化。

3 内源因子调控体外细胞培养研究表明, 在培养基中加入TNF-A、IL-1B可以使内皮细胞分泌肝素酶蛋白增加2-10倍, 而VEGF却可使肝素酶分泌降低。

脂肪酸可以促进肝素酶mRNA 和蛋白质的分泌[15] 。

雌激素( est rogen)可以诱导具有雌激素受体的乳腺癌细胞( MCF- 7) 肝素酶mRNA 的表达, 而在不具有雌激素受体的乳腺癌细胞系中则观察不到这一现象[ 16] 。

表明: 内因子可以刺激细胞分泌肝素酶, 这种刺激其实也使细胞获得在可溶性ECM中游走的能力。

Temkin 等报道[ 17] ,嗜曙红细胞碱性蛋白( MBP)是一种肝素酶天然抑制蛋白, 嗜曙红细胞虽然分泌肝素酶, 但是由于MBP 的存在, 嗜曙红细胞内都检测不到肝素酶的活性。

此外乙酰肝素酶可逐渐被一些蛋白酶, 如胰蛋白酶和尿激酶等灭活[ 18]。

4 乙酰肝素酶的生物学作用乙酰肝素酶作为HSPG 降解酶, 参与多种生理病理过程, 它具有以下生物学活性: ¹通过降解细胞外基质和血管基底膜促进癌细胞的侵袭和转移。

º诱导血管生成, 通过促进细胞分裂、趋化, 胶原纤维降解等, 恢复凋亡细胞活力。

也可直接促进血管内皮细胞的芽生和侵袭性生长通过促使HSPG 释放和活化肝素结合型的生长因子( 如bFGF, VEGF等) 诱导血管生成; 乙酰肝素酶还能加强蛋白激酶B/ Akt 信号转导途径, 激活邻近的内皮细胞, 刺激磷脂酰肌醇( - 3) 激酶依赖的内皮细胞的侵袭和转移,为血管生成创造条件[ 19] 。

Imada T[ 20] 等通过对侵袭性乳腺癌研究表明, 肝素酶还可能通过COX- 2途径来促进血管生成。

乙酰肝素酶还可增强脂质代谢, 促进血管的胆固醇化[ 21] 。

»对HSPG 的降解产物, 可以抑制活化T 淋巴细胞的生物学功能引起免疫抑制。

¼释放结合在HS 中含有尿激酶型纤溶酶原激活物( uPA) 和组织纤溶酶原激活物( tPA) , 溶解基质网状结构。

活化表皮生长因子( EGF) , 激活细胞外基质中的金属蛋白质酶( MMPs ) , 促进细胞的增殖和转移。

½由于乙酰肝素酶对HSPG 的降解可促进平滑肌细胞增生, 因而可促进动脉粥样硬化的形成。

¾乙酰肝素酶对HS 和肝素的降解, 解除了拓扑异构酶Ñ导致的解螺旋抑制效应, 从而促进DNA 复制, 细胞增殖和转移。

4. 1 乙酰肝素酶促进肿瘤侵移机制乙酰肝素酶的表达水平与肿瘤的转移有很大的相关性, 归纳如下: 1、破坏限制肿瘤生长转移的屏障ECM 和BM;乙酰肝素酶降解HSPG, 与其他基质降解酶( 如MMPs、丝氨酸蛋白酶) 协同破坏、降解ECM 和BM 屏障, 促进释放内皮下u- PA 及t -PA, 激活纤溶酶原, 活化MMPs, 裂解ECM、BM 中结构蛋白。

u- PA 和t- PA 还可通过活化表皮生长因子( EGF) , 激活细胞外基质中的蛋白酶联反应,使酶的屏障功能减退。