肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成与结构

食品与药品 Food and Drug 2012年第 14卷第09期
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的研究仍在继续且日益增多。原因主要有两点，一是肝素 的其他生物活性在治疗方面有开发潜力，例如调节血管生 成，肿瘤转移，和病毒入侵；二是肝素-蛋白质结合作为一 种模型，适用于细胞表面的HSPG的HS链中拥有高度硫酸 化区域（NS域）的蛋白质相互作用。
合五糖序列 也不相同。HS的结构域由重复的GlcA-(1→4)-GlcNAc二糖 （NA域）以及高度硫酸化的肝素样IdoA-(1→4)-GlcNS二糖 （NS域）组成（图 2）。NA和NS结构域被NA/NS转变区 段分开，转变区段由包含GlcNAc-和GlcNS-的二糖组成。 HS结构的多样性使其具有多种生物功能。
N-去乙酰化/N-硫酸化后，C5差向异构酶催化GlcA转 化为IdoA，在不同部位O-磺基转移酶催化得到O-硫酸化。 C5差向异构酶的特异性和机制已经详细描述；C5差向异构 化的必要条件是GlcA底物连接到GlcNS残基的还原端上。 因此，GlcNS-(1,4)-GlcA-(1,4)-GlcNS和GlcNS-(1,4)-GlcA(1,4)-GlcNAc序列中的GlcA是C5差向异构酶的底物，从而 形成有不同的O-硫酸酯取代基的GlcNS-(1,4)-IdoA-(1,4)GlcNS和GlcNS-(1,4)-IdoA-(1,4)-GlcNAc序列，这两个序 列均在肝素中被发现。然而，C5差向异构化不完全所以 GlcNS-(1,4)-GlcA-(1,4)-GlcNS 和 GlcNS-(1,4)- GlcA-(1,4)GlcNAc序列也同样在肝素中被发现。由于C5差向异构酶 的底物特异性，GlcNAc-(1,4)-GlcA-(1,4)-GlcNS 和GlcNAc(1,4)-GlcA- (1,4)-GlcNAc序列中的GlcA不是其底物，所以 肝素中均有这些序列，而Glc- NAc-(1,4)-IdoA-(1,4)-GlcNS 和 GlcNAc-(1,4)-IdoA-(1,4)- GlcNAc序列不存在。
单糖形成的24种糖醛酸和D-葡糖胺1-4连接二糖单位是 肝素和HS的基本序列单元。在这些序列中，肝素中最常见 的是IdoA(2S)-(1-4)-GlcNS(6S)（图1），在牛肺来源肝素中 高达90%，猪肠黏膜肝素中占70%。单糖的其他结合组成二 糖组成剩余部分（图 1）。
HS的一级结构与肝素明显不同。两者二糖亚基的比 例也不同，HS中GlcA/IdoA和GlcNAc/GlcNS的比值较高， SO4含量相对较低，并根据细胞类型和细胞分化程度，形成 多种编码产生高密度信息的精细结构。HS中，未硫酸化的 GlcA-(1→4)-GlcNAc二糖序列最为普遍。二糖亚基的组成
[GlcA-(1,4)-GlcNAc]n聚合物链向肝素的转化从GlcNAc 残基的N-乙酰基被硫酸基的取代开始。N-去乙酰/N-硫酸 化作用在聚合物链的任意部位开始，然后沿着链延长直到 在肝素中遇到孤立的乙酰化残基，例如GlcNS-(1,4)-GlcA(1,4)-GlcNAc-(1,4)-GlcA-(1,4)- GlcNS序列中的GlcNAc残 基。肝素中存在孤立GlcNAc残基，据此推测它们不是N-去 乙酰化酶的底物。肝素中发现未取代的GlcN残基，这表明 N-去乙酰化和N-硫酸化在体内同时发生。所有随后修饰依 赖于识别底物的N-硫酸基，因此，N-去乙酰化/N-硫酸化在 决定肝素精细结构中起关键作用。
HS也是以蛋白聚糖形式生物合成的。与仅能在肥大细 胞内合成的肝素相比，HS蛋白聚糖（HSPG）能在大多数 哺乳动物细胞内合成和表达。HSPG分布在细胞表面和细胞 外基质（ECM）中。HSPG可分为几个家族，每个家族含 一个特异的核心蛋白。HS链很少以游离状态存在。本文中
R′=SO3-或COCH3 抗凝血酶的最小结合位点 图1 肝素的主要和次要二糖重复序列及独特的抗凝血酶结
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·知识介绍·
肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成与结构
Rabenstein D L
1 概述
肝素和HS是一类由糖醛酸和D-葡糖胺二糖重复单位以
1-4键连接形成的线性多糖。二糖单位的N-硫酸基、O-硫酸
基、N-乙酰基等多种可变取代形成了多种复杂的序列。肝 素和HS是糖胺聚糖（GAG）家族（包括硫酸软骨素、硫酸 皮肤素和硫酸角质素）中结构最复杂的一类成员。
所述的HS包括游离的HS链和HSPG中的HS链。
肝素发现于1916年。自1935年以来，肝素一直作为一
种抗凝血药物应用于临床。肝素是仅次于胰岛素的天然药
物。而HS的研究历史较短。起初，HS是作为肝素杂质被发
现的，研究发现，HSPG中的HS链在多种生物过程中起关 键作用。
NS域
NA域
肝素和HS由相同的单糖构成。在通过1-4键相连的糖 醛酸和葡糖胺组成的二糖重复单元中，糖醛酸可以是α-L艾杜糖醛酸（IdoA）或是β-D-葡糖醛酸(GlcA)，两者都可 2-O-硫酸化[IdoA(2S)和GlcA(2S)]。β- D-葡糖胺(GlcN)可以 是N-硫酸化(GlcNS)或是N-乙酰化(GlcNAc)，两者都可6-O硫酸化(GlcNS(6S)和GlcNAc(6S))，同时GlcNS和GlcNS(6S) 也可以3- O-硫酸化[GlcNS(3S)和GlcNS(3,6S)]。
2.2 HS
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HSPG的多糖链比肝素少且短。HSPG的表达以一种组 织特异性方式发生，且在发育、老化、疾病过程中改变。 例如，细胞表面HSPG的HS链由未分化的HT29和分化的 HT29MTX-3产生，HT29MTX-6和 CACO2人结肠癌细胞产生 的HS链在大小和硫酸化程度上不同。在一项相关研究中， 发现在人结肠癌细胞发展为恶性肿瘤的过程中HS的整个分 子结构受到保护，但是在NS域和NA/NS转变区中，2-O-硫 酸化、N-硫酸化（在癌细胞中减少）和S6-O-硫酸化（增 加）水平存在不同程度的修饰。第二个例子，从神经前体 细胞的增殖到神经元分化的转变，伴随着6-O-硫酸化、总 链长和主要HS种类中硫酸化区域数量的改变。有两种主要 的细胞表面HSPG亚族，即黏结蛋白聚糖（4个）和磷脂酰 肌醇蛋白聚糖（6个），其主要区别在于核心蛋白氨基酸序 列及与细胞膜相互作用的方式不同；黏结蛋白聚糖的核心 蛋白贯穿细胞膜，而磷脂酰肌醇蛋白聚糖的核心蛋白通过 糖基磷脂酰肌醇(GPI)末端附着在细胞膜上。胞外基质中的 HSPG（基底膜蛋白聚糖、聚集蛋白和胶原XVIII）的区分 也在于它们的特异核心蛋白。
肝素的主要重复二糖
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
R=H或SO3R′=SO3-或COCH3 肝素的次要重复二糖
肝素由结缔组织型肥大细胞表达，以肝素蛋白聚糖的
形式被生物合成（Mr 750 000-1000 000）。肝素蛋白聚糖是 由一个独特的核心蛋白（丝甘蛋白）和与其共价连接的多 种肝素多糖链（Mr 6 000-100 000）组成。后期合成中，肝 素链随机断开形成较小肝素多糖（Mr 5 000-25 000）多分散 混合物，与碱性蛋白酶形成非共价复合物储存在肥大细胞 的胞质分泌颗粒中。
图2 HS的域结构 肝素的抗凝血活性众所周知，肝素的其他生物活性包 括释放脂蛋白脂酶及肝脂酶，抑制补体活化，抑制血管生 成和肿瘤生长，以及抗病毒活性。肝素的生物活性通过与 蛋白质的相互作用产生，最具特征的是与抗凝血酶（AT） 的相互作用，抗凝血酶是一种介导肝素抗凝血活性的丝氨 酸蛋白酶抑制剂。研究发现，肝素制剂中只有约三分之一 的多糖链有抗凝血活性，且抗凝血活性依赖于一种独特 的具有抗凝血酶结合特性五糖序列（图 1）。伴随以上发 现，肝素与多肽及蛋白的相互作用在分子水平上的细节表 征已受到重视。研究的热点是肝素一级结构的表征及特定 寡糖结构对其生物活性的影响。 在过去的数十年间，已经证明数百种蛋白质能与肝素 结合。结合所涉及的分子相互作用被不同程度地特征化， 包括在某些蛋白质中肝素-结合域的识别。但是，仅在肥大 细胞的分泌颗粒中发现肝素，所以有些关于肝素-蛋白结合 的生理学意义的质疑。尽管如此，对肝素-蛋白质结合特性
HS-蛋白质结合介导HSPG的多种生物功能，包括细胞 黏附，调节细胞生长及增殖，抑制血液凝结，以及脂蛋白 质脂酶和其它蛋白质与细胞表面的结合。HS在血管生成、 病毒侵袭和肿瘤转移方面起重要作用，这些都涉及HS-蛋白 质结合。尽管HS-蛋白质结合很重要，但目前关于HS-蛋白 质结合在分子水平上的研究相对较少，因为HS多糖的获得 量很少。然而近年来发展的测定HS寡糖一级结构的高灵敏 度方法，使该问题不再受限。尽管如此，我们目前对HS-蛋 白质结合的了解仍来自大量肝素及肝素衍生寡糖作为HS模 型应用的研究，原因是高度硫酸化肝素样例如NS域在HS蛋白质结合中是肝素的重要功能部分，其中（GlcA-(1,4)GlcNAc）x域作为活性域间的间隔区。
本文专注于肝素和HS的结构特性，包括用于获得结 构信息的方法、肝素和HS的功能、与肽和蛋白质的相互作 用。肝素和HS结构的复杂性由于它们前体不完全的生物合 成修饰，所以在关于它们结构介绍的上下文中，也综述了 肝素和HS生物合成。 2 生物合成 2.1 肝素
肝素的精细结构（图 1）是其前体进行不完全生物合 成修饰的结果。修饰反应服从于酶底物特异性和细胞调节 机制。对修饰酶底物特异性的大部分了解，来自于对纯化 酶和小鼠肥大细胞瘤离体细胞片段的研究，两者均在细胞 内调节肝素合成的机制可能无效的情况下进行。因此，当 底物特异性通过这些研究建立，它们可能不会反映肥大细 胞在体内产生什么。
已修饰的肝素蛋白聚糖的多糖链经内切-β-D-葡糖醛酸 糖苷酶在一些GlcA残基处裂解以得到更短的游离肝素链。 因为GlcA残基不能均匀地沿着肝素蛋白聚糖的肝素链分布 且并非所有的GlcA残基发生降解，所以降解肝素链混合物 是多分散的。市售合成肝素制剂的多分散性反映了分离自 肥大细胞（通常为牛肺和猪黏膜肥大细胞）的肝素状态。
其它O-硫酸化反应也可能发生，但发生几率很低。 GlcA残基的2-O-硫酸化与C5差向异构化竞争，形成少量 的GlcA(2S)，GlcA(2S)存在于序列GlcNS-(1,4)- GlcA(2S)(1,4)-GlcNS中。 GlcNAc残基毗邻含GlcNS的二糖，例如 肝素中孤立的GlcNAc残基，能被6-O-硫酸化。GlcNS和 GlcNS(6S)残基能被3-O-硫酸化，此为抗凝剂活性所必需的。
肝素以肝素蛋白聚糖的形式被生物合成，肝素蛋白聚 糖是由多个肝素多糖链共价连接到一个核心蛋白（丝甘蛋 白）上组成。例如，15个多糖链连接到鼠皮肤肝素蛋白聚 糖的20~25丝氨酸残基上。肝素多糖链的生物合成有3个阶 段：链的起始、聚合、聚合物修饰。链的起始包括一个木 糖（Xyl）残基、两个半乳糖（Gal）残基和一个葡糖醛酸 （GlcA）残基逐步连接到核心蛋白的特殊丝氨酸残基上， 从而形成连接子四糖β-GlcA-(1,3)-β-Gal-(1,3)-β-Gal-(1,4)-βXyl。1,4 连接的GlcNAc和GlcA单糖单位交替连接到连接 子四糖上构成肝素多糖链，从而形成[GlcA-(1,4)-GlcNAc]n 聚合物链，然后依次经过N-去乙酰化酶/N-磺基转移酶，差 向异构酶及O-磺基转移酶催化修饰，生成成熟硫酸乙酰多 糖。该聚合物修饰反应不完全，换言之，并不是所有可能 的底物残基都被修饰，因此，增加了产物结构的复杂性和 聚合物链的异质性。
差向异构化后，IdoA残基进行2-O-硫酸化，GlcNS残 基进行6-O-硫酸化。两个O-硫酸化反应程度受限于2-O-和 6-O-磺基转移酶的底物特异性，即任何GlcNS残基是6-O磺基转移酶的底物，而C1连接GlcNS(6S)的IdoA(IdoA(1,4)-GlcNS(6S))不是2-O-磺基转移酶的底物。在肝素中二 糖IdoA(2S)-(1,4)- GlcNS(6S)远比IdoA-(1,4)- N-GlcNS(6S) 丰富，这表明优势反应顺序为IdoA的2-O硫酸化，其次是 GlcNS的6-O-硫酸化。