硫酸乙酰肝素的序列与生物活性关系探究
肝素和硫酸乙酰肝素的功能
72 食品与药品 Food and Drug 2013年第15卷第1期肝素和硫酸乙酰肝素的功能Rabenstein D L内源肝素在肥大细胞内，是肥大细胞分泌颗粒的主要组成成分。
内源肝素在医学上作为抗凝血剂使用，并在预防和治疗血栓栓塞疾病中被作为首选药物。
硫酸乙酰肝素（HS ）在动物组织中广泛存在并且结构多样，同样也具有多种生物活性和功能，包括细胞黏附、调控细胞生长和增殖、发育过程和血液凝固、细胞表面结合脂蛋白脂肪酶和其它蛋白质、血管发生、病毒入侵和肿瘤转移。
HS 同样保护蛋白质不被降解，调控蛋白质通过基底膜转移，介导蛋白质内置。
研究发现细胞表面的HS 蛋白聚糖（HSPG ）是动态的，它能快速向细胞表面转移并快速返回（t ½1-4 h ），并通过细胞变化改变HS 的结构以应答细胞外信号因子，例如，生长因子。
肝素和HS 的作用机制涉及它们与蛋白质的非共价结合，以在蛋白质构象中发挥变化，促进蛋白质-蛋白质相互作用，使蛋白质在细胞表面分离并作为生长因子的复合受体发挥作用。
因为肝素和HS 在调节生物活性方面的作用，在综述一些肝素和HS 的功能之前，本文将探讨蛋白质-肝素相互作用的一些重要特点。
1 与蛋白的相互作用HSPG 的HS 链及肝素与蛋白质的结合主要是静电的，涉及阳离子铵盐基、胍盐以及与肝素或HS 的阴离子部位相互作用的多肽或蛋白质的咪唑侧链功能基团。
数百种与肝素结合的蛋白质已经被确认，且肝素结合性质经常被应用于它们的分离和纯化，即使用肝素亲和色谱。
在很多情况下，涉及到阳离子肝素-结合域与高负电荷肝素之间的非选择性相互作用，这导致通过HS 的蛋白质结合是相对非特异性的。
但是，研究者逐步认识到经设计的HS 的NS 和NA/NS 域中的特异序列可与特定蛋白质选择性相互作用，这种相互作用可用于调控蛋白质活性。
结合的选择性可以通过一种“稀有”成分的使用来得到，例如，在肝素抗凝血酶结合戊糖序列中存在的GlcNS(3，6S)残基，它对于抗凝血活性是必需的。
硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在神经损伤再生反应中的作用
硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在神经损伤再生反应中的作用朱莉(综述);吴连俊(综述);王彦亮(审校)【摘要】硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）由核心蛋白和硫酸乙酰肝素共同组成，主要有多配体蛋白聚糖、磷脂酰肌醇蛋白聚糖、基膜蛋白聚糖和集聚蛋白四大类别，广泛参与神经从轴突生长和运动终板恢复到骨骼肌细胞再生的全过程。
本文就HSPG及其在轴突生长过程中的引导作用、在神经元损伤-修复过程中的表达变化、在神经肌肉接点形成过程中的作用等研究进展作一综述。
%Heparan?sulfate?proteoglycan(HSPG)?is?found?in?the?extracellular? matrix?and?composed?of?a?core?protein?and?heparan?sulfate.?HSPG?ma y?be?categorized?into?four?families,?namely,?syndecans,?glypicans,?perle cans,?and?agrins,?all?of?which?broadly?participate?in?various?processes?fr om?axonal?growth?and?motor?end-plate?recovery?to?skeletal?muscle?cell?regeneration.?This?review?focuses? on?HSPG?and?its?guiding?function?in?the?axonal?growth?process.?It?also discusseschangesintheneuronaldamageexpression-repair?process?and?the?function?of?HSPG?in?the?formation?process?of?n eural?muscle?junctions.【期刊名称】《国际口腔医学杂志》【年(卷),期】2013(000)005【总页数】4页(P687-690)【关键词】硫酸乙酰肝素;蛋白聚糖;糖胺聚糖;神经损伤;再生【作者】朱莉(综述);吴连俊(综述);王彦亮(审校)【作者单位】温州医学院附属口腔医院修复科温州 325052;温州医学院口腔医学院口腔医学研究所温州 325035;温州医学院口腔医学院口腔医学研究所温州325035【正文语种】中文【中图分类】R51蛋白聚糖（proteoglycan，PG）由糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）和蛋白质结合而成。
乙酰肝素酶的生物学特性的研究进展
乙酰肝素酶的生物学特性的研究进展
凌焱;汤国营;陈惠鹏
【期刊名称】《生物技术通讯》
【年(卷),期】2005(16)1
【摘要】乙酰肝素酶是切割哺乳动物细胞中硫酸肝素蛋白多糖侧链--硫酸乙酰肝素的内源性糖苷酶,是抗肿瘤转移的理想靶点.本文就乙酰肝素酶的分子结构特点、亚细胞定位、活性调控机制、与肿瘤转移的关系、底物特异性和抑制剂开发等方面的研究进展进行了综述.
【总页数】3页(P68-70)
【作者】凌焱;汤国营;陈惠鹏
【作者单位】军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071
【正文语种】中文
【中图分类】Q556.2
【相关文献】
1.乙酰肝素酶与相关疾病的研究进展 [J], 罗东;周容(综述);王艳云(审校)
2.乙酰肝素酶在膜性肾病中的研究进展 [J], 吕喆;刘建华;秦晓松
3.乙酰肝素酶非酶活性促进肿瘤侵袭转移的研究进展 [J], 尚钐钐;马秀梅
4.乙酰肝素酶在心肌缺血/再灌注损伤中表达的研究进展 [J], 曹洪帅;韩轩茂
5.乙酰肝素酶与多配体蛋白聚糖-1在恶性肿瘤中的研究进展 [J], 闻波;陈佳伟;王郑林;周少波
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肝素和硫酸乙酰肝素的功能
肝素和硫酸乙酰肝素的功能
Rabenstein D L;赵丽娟;樊志萍;边玲
【期刊名称】《食品与药品》
【年(卷),期】2013(015)001
【摘要】内源肝素在肥大细胞内，是肥大细胞分泌颗粒的主要组成成分。
内源肝素在医学上作为抗凝血剂使用，并在预防和治疗血栓栓塞疾病中被作为首选药物。
硫酸乙酰肝素（HS）在动物组织中广泛存在并且结构多样，同样也具有多种生物活性和功能，包括细胞黏附、调控细胞生长和增殖、发育过程和血液凝固、细胞表面结合脂蛋白脂肪酶和其它蛋白质、血管发生、病毒入侵和肿瘤转移。
【总页数】3页(P72-74)
【作者】Rabenstein D L;赵丽娟;樊志萍;边玲
【作者单位】
【正文语种】中文
【相关文献】
1.硫酸乙酰肝素结构功能多样性与硫酸化修饰
2.硫酸乙酰肝素/肝素的药用价值研究进展
3.小鼠硫酸乙酰肝素2-O-硫酸基转移酶Hs2st的生理功能和体外应用
4.反相液相色谱-电喷雾-离子阱-飞行时间质谱法定量分析N-非取代肝素/硫酸乙酰肝素
5.肝素/硫酸乙酰肝素四糖同分异构体的制备与表征
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硫酸类肝素的结构_功能_修饰与合成
1
引言
蛋白质、 基因和多糖是构成生命科学的三大主 要领域。随着人类基因组学和蛋白组学研究的日益 成熟, 科学工作者发现, 人的基因数目约有32 000 左 右, 比预想的十万左右要少, 无法全面解释各种复杂 [ 1] 的生命现象 。糖类化合物除了作为能量物质和细 胞的结构物质之外 , 还可以作为信息分子参与体内 的各种识别, 是连接基因 蛋白质体系, 活细胞体系 与整个有机体的桥梁。只有在以基因为模板合成的 蛋白质上添加糖链 , 糖链接着被硫酸化、 磷酸化 , 所 构成的庞大而复杂的体系才为解释生命现象的复杂 性提供了可能 。然而由于人类对糖类化合物的研 究相对滞后, 到目前为止仍然处于初级阶段。 糖胺聚糖是糖类化合物中备受关注的一类, 因 为它不仅本身独立承载着多种生物功能, 还是蛋白 [ 3] 聚糖中糖链部分的主要存在形式 。硫酸类肝素是
[ 14]
些细胞器中
, 它们能够与数百种蛋白质相结合, 影
响蛋白质的空间构象、 寿命和生物活性。如表 1 所 [ 6,7, 11] 示 , 硫酸类肝素可以与各种细胞因子相结合 ,
# 1138 #
化
学
进
展
[ 20]
第 20 卷
影响生物体的成长和发育; 与多种生物酶及酶抑制 剂相结合, 如各种载脂酶
[ 19] [ 17,18]
收稿 : 2007 年 9 月 , 收修改稿 : 2007 年 12 月
[ 2]
2
分子结构解析
糖组分分析表明 , 硫酸类肝素是由糖醛酸和葡 糖胺以 1 ! 4 键连接起来的呈线性结构的聚糖 , 其分
* 国家自然科学基金项目 ( No. 20773203) 、 福建省重点科技平台建设项目 ( No. 2006F1003) 资助 * * 通讯联系人 e mail: wei@ fzu. edu. cn
《肝素和硫酸乙酰肝素对乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响》
《肝素和硫酸乙酰肝素对乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响》一、引言乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居高不下。
其中，肿瘤细胞的侵袭和转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。
近年来，随着对乳腺癌发病机制的不断深入研究，人们发现肝素和硫酸乙酰肝素等糖胺聚糖类物质在乳腺癌的进展中扮演着重要角色。
本文旨在探讨肝素和硫酸乙酰肝素对乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响，为乳腺癌的预防和治疗提供新的思路和方向。
二、肝素和硫酸乙酰肝素概述肝素是一种由葡萄糖胺和葡萄糖醛酸组成的天然抗凝剂，具有广泛的生物活性。
而硫酸乙酰肝素则是一种由肝素和硫酸基团组成的糖胺聚糖，广泛存在于细胞表面和细胞外基质中。
这两种物质在生物体内具有多种生理功能，包括抗凝、抗炎、抗肿瘤等。
三、肝素对乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响研究表明，肝素能够通过多种途径影响乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。
首先，肝素能够与肿瘤细胞表面的某些受体结合，抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。
其次，肝素还能够影响肿瘤细胞与基质之间的相互作用，减少肿瘤细胞的侵袭能力。
此外，肝素还能够通过调节肿瘤细胞内的信号传导途径，抑制肿瘤细胞的转移。
四、硫酸乙酰肝素对乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响硫酸乙酰肝素在乳腺癌细胞的侵袭和转移过程中也发挥着重要作用。
研究表明，硫酸乙酰肝素能够通过与肿瘤细胞表面的某些受体结合，促进肿瘤细胞的增殖和迁移。
此外，硫酸乙酰肝素还能够影响肿瘤细胞与基质之间的相互作用，增强肿瘤细胞的侵袭能力。
因此，在乳腺癌的治疗中，需要针对硫酸乙酰肝素的作用进行深入研究，以寻找有效的治疗方法。
五、研究方法及结果为了进一步探讨肝素和硫酸乙酰肝素对乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响，许多学者进行了相关研究。
他们通过体外实验和动物模型等方法，研究了肝素和硫酸乙酰肝素对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响。
结果显示，适当浓度的肝素能够抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力，而硫酸乙酰肝素则具有促进乳腺癌细胞侵袭和转移的作用。
肝素和硫酸乙酰肝素的功能
于它们 的分离和 纯化 ，即使用肝素亲 和色谱 。在很 多情 况 的生 理意义 。通 过敲 除大 鼠Ⅳ． 脱酰 酶／ Ａ Ｌ 磺 基转 移酶 的基 下 ，涉及 到 阳离子 肝素 ． 结 合域 与 高负 电荷肝 素之 间 的非 因， “ 正 常 ”即硫酸 化肝素 的生物 合成被 阻止 。这 使得分 选择性相 互作用 ，这 导致通 过Ｈ Ｓ 的蛋 白质结合是相对 非特 泌颗粒 中其它生物活 性调控 因子的数 目改变，其 中最显著
保护蛋 白质不被 降解 ，调控 蛋 白质通 过基底膜转 移 ，介 导 蛋 白质 内置 。研 究发现细 胞表面 的ＨＳ 蛋 白聚糖 （ ＨＳ Ｐ Ｇ）
由于肝素￣ Ｉ Ｉ ＨＳ 的高负 电荷密度 ，它们都是 聚电解质 ， 通过 结合反离 子 中和部分 负 电荷 。所 以，结 合反应是一 个
是动 态 的 ，它能 快速 向细 胞表 面转 移 并快 速返 回 （ ｔ １ — ４ 离子 交换过程 ，结合 多肽 或蛋 白质 的阳离子 部位即为反 离 ｈ ） ， 并 通 过 细 胞 变 化 改变 ＨＳ 的结 构 以应 答 细 胞 外 信 号 因 子 。 反 离 子 结 合 模 型 显 示 水 溶 液 中 的 肝 素 钠 的Ｎａ 部 分 被 子 ，例 如 ，生 长 因 子 。肝 素 和 ＨＳ 的作 用 机 制 涉 及 它 们 与 蛋 结 合 ， 为 每 一 个 负 电荷 是 ０ ． ５ ９ ； 已经 报 道 了０ ． ５ ８ ￣ Ｈ ０ ． ６ ３ 的 实
７ ２
食 品与药 品
Ｆ ｏ ｏ ｄ ａ ｎ ｄ Ｄ ｒ ｕ ｇ
２ ０ １ ３ 年第 １ ５ 卷第 １ 期
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知识介绍 ・
肝 素和硫 乙酰肝 素的功 能
Ｒａ ｂ ｅ ｎ ｓ ｔ ｅ ｉ ｎＤ Ｌ
乙酰肝素酶研究
乙酰肝素酶研究进展乙酰肝素酶( heparanase, Hpa) 是近年发现的肿瘤重要功能酶, 是体内唯一能够降解糖氨聚糖中的硫酸乙酰肝素( heparan sulfat , HS) 链的内切糖苷酶,特异识别HS 侧链上的特异性位点, 可以在特定部位裂解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在各种蛋白聚糖中最具生物活性,它参与多级联细胞粘附反应过程,并与粘附分子、细胞因子、细胞间信号分子等相互作用,在影响细胞增殖、分化、迁移及形态等方面具有重要作用,在各种炎症损伤、缺血再灌注损伤、血栓形成及肿瘤转移等过程中具有重要功能。
( heparan sulfate protoglycan,HSPG) , 将HS 裂解为10~ 20 个糖单位大小的短糖链, 并释放结合在HS 上的生长因子。
乙酰肝素酶可促进细胞的浸润和转移, 还可以促进肿瘤细胞分裂、趋化、微血管形成。
是目前在哺乳动物中发现的唯一一个可以剪切HSPGs 上HS 侧链的水解酶, 是抗肿瘤的理想靶点。
细胞发生侵袭转移首先要穿越由细胞外基质和基底膜组成的屏障。
该屏障主要有两种成分构成:一是结构蛋白, 包括胶原、层黏素、纤维结合素和玻璃体结合素等, 二是糖氨聚糖, 主要成分是HSPG,是广泛存在于脊椎动物组织细胞外基质( extracellular matrix, ECM) 和细胞表面的复杂的生物大分子,是构成基底膜的主要成分。
HSPG 主要由一个核心蛋白和数个与之共价连接的线性HS 侧链组成[ 1] ,HS 是由己糖醛酸和葡胺聚糖组成的重复单位构成。
HSPG 能与细胞表面及ECM 中的活性分子结合, 粘附于细胞表面, 是细胞外基质聚集和稳定的基础, 拥有限制细胞迁移、粘附和选择性分子筛的重要作用, 还可以与多种生物活性分子结合并相互作用。
事实上HSPG 的降解是细胞侵袭前所必需的, 当HSPG 被乙酰肝素酶降解后, 就会产生一系列生物学现象如妊娠形态发生、炎症反应、血管生成、肿瘤的侵袭和转移[ 2] 。
浅析系列肝素药物质量分析及控制研究
浅析系列肝素药物质量分析及控制研究肝素是一种常用的抗凝剂药物，在临床上被广泛应用于预防和治疗静脉血栓栓塞症、心肌梗塞和其他血栓疾病。
随着人们对肝素药物质量的认识逐渐加深，对其药物质量分析及控制的研究也变得愈发重要。
本文将对肝素药物质量分析及控制进行浅析，旨在为相关研究和实践提供参考。
一、肝素的药物质量分析1. 成分分析肝素主要是由硫酸甘露醇和硫酸半乳糖苷组成的一种多糖葡萄糖苷。
在肝素的药物质量分析过程中，需要对这两种成分进行定量分析，并确保其含量符合药典标准要求。
成分分析的准确性对于保证肝素的药物质量至关重要，因此需要选择合适的分析方法，并采用精密的仪器设备进行检测。
2. 结构分析肝素的多糖结构包含有不同程度的硫酸化，而硫酸化程度的不同影响着肝素的生物活性和药物质量。
对肝素的结构分析至关重要。
常用的结构分析方法包括核磁共振（NMR）技术、质谱（MS）技术等，通过这些技术可以得到肝素分子结构的信息，为进一步的药物质量控制提供依据。
3. 生物活性分析肝素的生物活性主要表现为其对凝血酶的抑制作用。
生物活性分析通常采用活化部分凝血活酶时间（APTT）等体外凝血试验来评估。
在肝素的药物质量分析过程中，需要对其生物活性进行定量分析，并制定合理的药物质量标准，以保证其在临床上的疗效和安全性。
二、肝素的药物质量控制研究1. 生产工艺控制肝素的生产工艺直接影响着其药物质量，包括原料选择、提取工艺、纯化工艺等。
对生产工艺的控制研究，可以有效地提高肝素的纯度和稳定性，保证其药物质量符合标准要求。
2. 质量标准制定根据肝素的成分分析、结构分析和生物活性分析结果，可以制定相应的质量标准，包括成分含量、结构特征、生物活性等指标。
质量标准的制定需要充分考虑肝素的临床应用需求，确保其在临床上的疗效和安全性。
3. 质量控制方法针对肝素的药物质量特点，需要建立相应的质量控制方法，包括成分分析方法、结构分析方法、生物活性分析方法等。
肝素和硫酸乙酰肝素前体Heparosan的合成研究进展
肝素和硫酸乙酰肝素前体Heparosan的合成研究进展夏亚穆;戴晓丽【摘要】肝素(Hep)和硫酸乙酰肝素(HS)是糖胺聚糖家族中的一类线性多糖,作为抗凝血药物广泛应用于临床中,在抗癌、抗病毒等方面也具有一定的作用.Heparosan是肝素和硫酸乙酰肝素共同的前体,决定着聚合物链的长度和糖单元主链的组成,也是其生物活性结构参数的决定因素.介绍了肝素/硫酸乙酰肝素的合成方法,综述了Heparosan的合成研究进展,并对生物工程领域合成Heparosan的前景进行了展望.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2013(030)009【总页数】4页(P1-4)【关键词】肝素;硫酸乙酰肝素;糖胺聚糖;Heparosan合成;Heparosan合酶【作者】夏亚穆;戴晓丽【作者单位】青岛科技大学化工学院,山东青岛266042;青岛科技大学化工学院,山东青岛266042【正文语种】中文【中图分类】TQ929.2糖胺聚糖（GAGs）是一类由重复的二糖单元组成的不分支的带负电荷的多糖，通过参与细胞粘附、趋化因子信号传导、生化级联、信号转导以及病原体识别等在细胞中起到关键作用。
鉴于其生理功能，糖胺聚糖组成了一类具有巨大治疗应用潜力的化合物［1，2］。
其中，肝素（Hep）和硫酸乙酰肝素（HS）是糖胺聚糖家族的重要成员，是一类由糖醛酸和D－葡糖胺二糖重复单元以1，4－位键连接形成的线性多糖，其结构复杂、生物活性多样［3－6］，研发肝素和硫酸乙酰肝素新药已成为近年来多糖药物研究的热点。
Heparosan，又称 N－Acetylheparosan，［β－D－1，4－GlcA－α－D－GlcNAc］n（其中：GlcA 代表葡糖醛酸、Glc－NAc代表N－乙酰氨基葡糖），是肝素和硫酸乙酰肝素共同的前体，也是它们合成过程中最重要的模板［7］。
作者在此介绍了肝素／硫酸乙酰肝素的合成方法，综述了Heparosan的合成研究进展，并对生物工程领域合成Heparosan的前景进行了展望。
肝素结构与功能的研究进展_高宁国
《生物工程进展》1999,V ol.19,No.5研 究进 展肝素结构与功能的研究进展 高宁国 程秀兰 杨 敬 张树政(中国科学院微生物研究所 北京 100080)摘要 肝素是一类结构异常复杂的糖胺聚糖,与此相对应的是其多种生物学功能。
除了经典的抗凝血及其相关的抗血拴生成以外,肝素还具有抗平滑肌细胞增殖、抗炎症、抗肿瘤及抗病毒等,并且这些生物活性同抗凝活性无关,而同肝素的特异结构密切相关。
本文综述了肝素的多种生物学功能、作用机制及结构与功能的关系。
关键词 肝素 生物学功能 作用机制 结构与功能 肝素是一类糖胺聚糖,由糖醛酸和葡萄糖胺以1→4键连接起来的重复二糖单位组成的多糖链的混合物。
含10—30个二糖单位不等,分子量4000—20000,平均分子量12000。
2-O -硫酸-A -L 艾杜糖醛酸及6-O-硫酸-N-硫酸-A -D 葡萄糖胺是其中的主要单糖,由它们组成的三硫酸二糖的重复单位构成了肝素的所谓“规则区”,是肝素结构的主要部分,另外的单糖残基,如A -L -艾杜糖醛酸,6-O -硫酸-N -乙酰-A -D 葡萄糖胺,B -D 葡萄糖醛酸及3-6-双-O-硫酸-N -硫酸-A -D 葡萄糖胺以很低的频率出现于“非规则区”。
一定数目的6位无硫酸化的葡萄糖胺及2-O-硫酸-A -D 葡萄糖醛酸的存在,使得肝素中出现了10种不同的单糖(4种糖醛酸和6种葡萄糖胺),从而使得肝素的整个结构变得异常复杂,到目前为止,肝素的精确结构还不清楚[1]。
与复杂结构相对应的是其复杂的生物学功能,自从1937年肝素在临床上用作抗凝剂以来,肝素一直是一种主要的抗凝药物,除了抗凝活性及其相关的抗血栓生成活性以外,近来发现肝素具有抑制平滑肌细胞增殖,抗炎症,抗肿瘤及抗病毒等生物学功能。
1 抗凝血与抗血栓生成血凝过程包括一系列酶原激活过程,在凝血过程的每一步,一种酶原被转化为相应的丝氨酶蛋白酶,并用来催化下一步酶原-丝氨酶蛋白酶转化反应,最终将无活性的凝血酶原转化为有活性的凝血酶,将可溶性的纤维蛋白原转化为不溶性的纤维蛋白从而引起血液凝固[2]。
肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成与结构
食品与药品 Food and Drug 2012年第 14卷第09期
VII
的研究仍在继续且日益增多。原因主要有两点，一是肝素 的其他生物活性在治疗方面有开发潜力，例如调节血管生 成，肿瘤转移，和病毒入侵；二是肝素-蛋白质结合作为一 种模型，适用于细胞表面的HSPG的HS链中拥有高度硫酸 化区域（NS域）的蛋白质相互作用。
合五糖序列 也不相同。HS的结构域由重复的GlcA-(1→4)-GlcNAc二糖 （NA域）以及高度硫酸化的肝素样IdoA-(1→4)-GlcNS二糖 （NS域）组成（图 2）。NA和NS结构域被NA/NS转变区 段分开，转变区段由包含GlcNAc-和GlcNS-的二糖组成。 HS结构的多样性使其具有多种生物功能。
N-去乙酰化/N-硫酸化后，C5差向异构酶催化GlcA转 化为IdoA，在不同部位O-磺基转移酶催化得到O-硫酸化。 C5差向异构酶的特异性和机制已经详细描述；C5差向异构 化的必要条件是GlcA底物连接到GlcNS残基的还原端上。 因此，GlcNS-(1,4)-GlcA-(1,4)-GlcNS和GlcNS-(1,4)-GlcA(1,4)-GlcNAc序列中的GlcA是C5差向异构酶的底物，从而 形成有不同的O-硫酸酯取代基的GlcNS-(1,4)-IdoA-(1,4)GlcNS和GlcNS-(1,4)-IdoA-(1,4)-GlcNAc序列，这两个序 列均在肝素中被发现。然而，C5差向异构化不完全所以 GlcNS-(1,4)-GlcA-(1,4)-GlcNS 和 GlcNS-(1,4)- GlcA-(1,4)GlcNAc序列也同样在肝素中被发现。由于C5差向异构酶 的底物特异性，GlcNAc-(1,4)-GlcA-(1,4)-GlcNS 和GlcNAc(1,4)-GlcA- (1,4)-GlcNAc序列中的GlcA不是其底物，所以 肝素中均有这些序列，而Glc- NAc-(1,4)-IdoA-(1,4)-GlcNS 和 GlcNAc-(1,4)-IdoA-(1,4)- GlcNAc序列不存在。
不同来源的硫酸乙酰肝素的制备及理化性质研究
2. 2. 1 乙醇分级沉淀 GAGs 粗品加水溶解后 ,依 溶液 ,波长 200～400 nm 范围内扫描 。
次加入 0. 6 和 1. 0 倍量的乙醇 ,5 ℃放置 2 h ,离心 , 2. 4 理化指标检测
沉淀脱水干燥 。用 CAME 观察分级沉淀物中各种 2. 4. 1 糖醛酸含量的测定 按文献[ 3 ]方法进行 。
滤液
D 204
树脂 稀盐酸
洗涤后树脂
洗脱 3 mol/ L 氯化钠
洗脱液
过滤
滤液
沉淀 乙醇
沉淀物
(
GAGs
粗品)
所得 GAGs 用醋酸纤维素膜电泳 ( CAME) 观察 2. 3 纯度测定
各种 GAGs 的含量 。
2. 3. 1 CAME 按常规方法进行 。
2. 2 HS 的纯化
2. 3. 2 UV 检测蛋白质 、核酸 产品配成 0. 05 %的
ROCKVILLE ,MD ;硫酸皮肤素 、硫酸乙酰肝素 、硫酸 2. 1 GAGs 粗品的提取分离
软骨素 A 和 C ,美国 Sigma 公司 ;咔唑 ,瑞士 Fluka 公
提取分离的工艺流程如下 。
提取
酶解
离心
澄清过滤
离子交换吸附
酸性洗涤
猪肠黏膜 、牛肺 氯化钠溶液 提取液 蛋白酶 酶解液 离心液
Key words : heparan sulfate ; purification ; determination
硫酸乙酰肝素 ( heparan sulfate , HS) 是一类广泛 存在 于 动 物 细 胞 表 面 的 糖 胺 聚 糖 ( glycosaminogly2 cans , GAGs) ,由其与蛋白质构成的蛋白聚糖主要有 黏附蛋白聚糖 (syndecan 1～4) 、纤维蛋白聚糖 (fibro2 glycan) 、糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖 (glypican) 、β2蛋白 聚糖 (betagl ycan) 及 CD44 等[1] 。它们在动物细胞的 信号传导 、增生与分化 、免疫调节 、细胞黏附以及神 经细胞的信息传递等方面具有重要的生物学功能 。 HS 在组成糖基和糖苷键连接方式上类似肝素 ,但其 糖链中以由 β2D2葡糖醛酸和 22N2乙酰氨基 22脱氧 α2D2葡糖 (包括 C6 的 O2硫酸酯取代) 通过 (1 →4) 连
硫酸乙酰肝素的体外抗黑色素瘤作用
硫酸乙酰肝素的体外抗黑色素瘤作用
师佩兰;蒋志文;徐伟
【期刊名称】《实用医学杂志》
【年(卷),期】2010(026)002
【摘要】目的:研究硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)的体外抗黑色素瘤作用.方法:从培养的人乳腺上皮癌MCF-7细胞提取HS链,将HS以不同终浓度作用于人A375黑色素瘤细胞,倒置显微镜下观察受试细胞的形态变化:MTT法检测细胞生长抑制率;双染法观察其对细胞凋亡的影响;活性检测法测定细胞中酶caspase-3的变化.结果:HS可抑制A375细胞的生长和增殖,诱导细胞凋亡增加,并促进了caspase-3的活化.结论:来源于MCF-7细胞的HS具有较强的体外抗黑色素瘤作用.
【总页数】4页(P179-182)
【作者】师佩兰;蒋志文;徐伟
【作者单位】233004,蚌埠医学院第一附属医院药剂科;233004,蚌埠医学院第一附属医院药剂科;233004,蚌埠医学院第一附属医院药剂科
【正文语种】中文
【相关文献】
1.硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在脂蛋白代谢中的作用 [J], 夏霖;滕丽萍;陈敬华
2.乙酰硫酸肝素在造血系统及免疫系统中的作用 [J], 任红英
3.硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在胶质母细胞瘤肿瘤微环境中的作用研究进展 [J], 纪青;常青
4.肝素/硫酸乙酰肝素四糖同分异构体的制备与表征 [J], 杜佳燕;苏晓明;梁群焘;邹
强;魏峥
5.硫酸乙酰肝素蛋白聚糖及肝素对巨噬细胞脂质蓄积的抑制作用 [J], 杨方;赵培真;蔡海江;张英珊;叶刚;赵斌;韩晓男
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硫酸乙酰肝素3-O硫酸基转移酶5的表达、纯化及酶学性质研究
硫酸乙酰肝素3-O硫酸基转移酶5的表达、纯化及酶学性质研究陕婧婧;窦文芳;李会;张旦旦;许泓瑜;陈敬华;许正宏【摘要】经过PCR克隆得到硫酸乙酰肝素3-0硫酸基转移酶5(3-OST-5)的基因,将其与大肠杆菌表达载体pET-15b连接后,在大肠杆茵BL21( DE3)中诱导表达,使用镍亲和层析柱纯化得到具有活性的3-0ST-5.经测定纯化后的3-OST-5比活达到0.58 U/mg,是纯化前的5.27倍,回收率达80.4％.在此基础上,研究了该酶的酶学性质,酶反应的最适温度为35℃,稳定范围为20--40℃;最适pH为7.0,在pH7.0-9.0范围内稳定.在反应液中加入终浓度为1 mmol/L的K+、Ca2+、Ba2+对酶促反应有一定的促进作用.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2012(000)008【总页数】6页(P101-106)【关键词】硫酸乙酰肝素;3-O硫酸基转移酶5;表达;纯化;酶学性质【作者】陕婧婧;窦文芳;李会;张旦旦;许泓瑜;陈敬华;许正宏【作者单位】江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡214122;江南大学医药学院制药工程研究室,无锡214122;江南大学医药学院制药工程研究室,无锡214122;江南大学医药学院制药工程研究室,无锡214122;江南大学医药学院制药工程研究室,无锡214122;江南大学医药学院制药工程研究室,无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡214122;江南大学医药学院制药工程研究室,无锡214122【正文语种】中文肝素是一种含硫酸酯的黏多糖，产生于哺乳动物细胞表面，属不均一的多糖分子。
早在20世纪40年代初，西方研究人员既已发现肝素具有很强的抗凝血作用。
除此之外，肝素还具有降血脂、抗炎、抗肿瘤、抑制细菌黏附等作用[1-3]，是重要的糖胺聚糖类生化药物之一。
肝素类抗血栓药物在治疗心脑血管疾病时具有诸多优点，但同样存在诸如血小板减少症、骨质疏松、高血钾症等严重副作用及生物污染的风险。
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硫酸乙酰肝素的序列与生物活性关系探究蛋白聚糖是一类普遍存在于哺乳动物细胞表面和细胞外基质的大分子。
蛋白聚糖一般是由一个或多个糖胺聚糖链共价连接在核心蛋白上组成的。
糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAGs)是一类线性的长链碳水化合物,由于硫酸基团和羧基基团的存在因此带有大量的负电荷。
天然存在的糖胺聚糖主要分为四类包括硫酸乙酰肝素(Heparansulfate,HS)/肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸。
其中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖构成主要一类具有重要生物学活性的蛋白聚糖组。
肝素是一种细胞内的糖胺聚糖,主要存在于肥大细胞中。
肝素与HS具有相似的结构组成都是由糖醛酸(葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸,Glucronic acid(GlcA)和 Iduronicacid(IdoA))和葡萄糖胺(Glucosamine,GlcN)通过 1-4 糖苷键形成的二糖单元(-HexAα/β1,4-GlcNα1,4-)组成,在其合成过程中IdoA的2-位或GlcA的2-位以及GlcN的N-位、6-位或3-位会发生不同程度的硫酸化修饰,肝素的硫酸化程度要高于HS。
肝素/HS 与蛋白配体的结合主要是通过糖链的高负电荷与蛋白的正电荷之间的静电相互作用进行的。
通常认为肝素/HS与蛋白配体的相互作用主要依赖于糖链中羧基和硫酸取代基团的数目以及硫酸取代基团在糖链中的分布。
自二十世纪三十年代以来,肝素已被成功用作注射用抗凝血药物用于预防和治疗血栓性疾病。
肝素与抗凝血酶(Antithrombin,ATⅢ)的相互作用是目前研究最明确的肝素-蛋白配体结合实例。
肝素与ATⅢ的结合被称为“锁-钥”结合模式,主要依赖于肝素糖链中含有特殊3-O-硫酸化GlcN的戊糖序列(-GlcNS(orAc)6S-GlcA-GlcNS3S±6S-IdoA2S-GlcNS6S-)。
肝素中的特殊戊糖序列与ATⅢ结合,通过改变ATⅢ构象增加其对凝血因子(FactorXa,FXa)和凝血酶(Thrombin,FⅡa)的抑制活性,从而达到抗凝血作用。
低分子肝素(Low molecularweightheparins,LMWHs)是由肝素通过不同的降解条件包括酶降解和化学降解制备得到的,具有和母体肝素相同的单糖组成、硫酸和乙酰基团取代形式以及寡糖序列的一类具有较低分子量的抗凝血药物。
与肝素相比,LMWHs不具有肝素作为抗凝血药物表现出的药代动力学限制,例如LMWHs具有半衰期长、可预测的抗凝血反应和较低的不良反应效率如肝素诱导的血小板减少症(Heparin-induced thrombocytopenia,HIT)等特点。
LMWHs作为碳水化合物类药物与传统的小分子药物和生物大分子药物相比具有独特的结构特征。
LMWHs是由具有不同链长、单糖组成、硫酸和乙酰取代形式和序列的寡糖混合物组成。
直到2008年全球肝素污染事件发生,肝素和LMWHs结构表征的重要性才受到重视。
传统的分析方法包括凝胶渗透色谱分析得到的分子量(Molecularweight,MW)信息以及单糖组成分析和生物活性分析都不足以反映该多糖药物的精细结构并确保其安全性和有效性。
2010年美国食品和药物管理局(Food and drug administration,FDA)批准了第一个LMWHs 仿制药依诺肝素钠,为了保证LMWHs 仿制药与原研药结构一致性和药物安全性,迫切需要开发LMWHs精细结构的分析方法用来比较原研药和仿制药。
LMWHs的异质性可以从以下五个方面进行全面表征:(1)理化性质;(2)高分辨完整糖链分析;(3)寡糖片段分布;(4)二糖和基本组成单元分析和(5)寡糖序列分析。
传统的分析方法包括液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)、凝胶电泳、毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)和核磁共振波谱(Nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)分析不能提供每种寡糖的精细结构信息。
质谱技术,特别是与HPLC和CE在线联用的电喷雾质谱(Electrospray ionizsation mass spectrometry,ESI-MS)技术(LC/CE-ESI-MS)已经成为全面表征LMWHs的主要分析工具。
类似于蛋白组学分析的两种策略包括“自上而下”和“自下而上”已经广泛用于LMWHs的结构表征。
“自上而下”和“自下而上”两种策略应用LC-MS分析LMWHs可以提供LMWHs 基本组成信息包括完整糖链分布、寡糖片段分布和基本组成单元,同时每种寡糖得到的结构信息包括糖醛酸(Uronicacid,HexA)和GlcN的数目、寡糖末端结构、硫酸和乙酰基取代数目。
HS和肝素的生物活性很大程度上取决于其糖链中特殊的寡糖序列提供的能与多种蛋白配体相互作用的特殊结合位点。
这些特殊结构的序列分析对于了解GAG-蛋白相互作用机制是必不可少的。
目前研究最明确的肝素-蛋白相互作用的例子是肝素中特殊的戊糖序列与ATⅢ的特异性结合。
近些年来,对成纤维生长因子-2(Fibroblast growth factor-2,FGF-2)的研究表明 HS 中 IdoA2S 和 GlcNS是识别FGF-2所必须的,同时FGF-2的激活也需要HS中6-O-硫酸基团的存在。
HS/肝素与其他生长因子的结合如FGF-1、FGF-4、肝细胞生长因子和血管细胞生长因子也被证明是依赖于HS/肝素独特的结构特征,进一步证明了 HS/肝素糖链中存在与蛋白相互作用的特殊结合位点。
此外,在LMWHs制备过程中,经过化学或酶降解后的肝素,糖链中主要的ATⅢ结合的戊糖序列被保留,而更长的FIIa因子结合区域可能已经被破坏。
肝素诱导的副作用,HIT,也证明与肝素糖链中的寡糖序列密切相关。
以上两个方面包括GAGs-蛋白配体相互作用机制研究和LMWHs抗凝血药物的安全性和有效性都需要对糖链中特殊的寡糖序列进行序列表征。
然而,由于目前缺乏GAGs精确结构的分析方法使得对HS/肝素中与蛋白配体相互作用的确切的结构信息知之甚少。
本论文的目标之一就是以低分子肝素达肝素钠作为研究对象,开发分析方法表征达肝素钠中较短寡糖的序列结构,为进一步探究肝素/HS与目标蛋白相互作用的特殊寡糖序列的表征提供研究基础。
天然来源分离得到的HS和肝素是高度异质性的混合物,主要由不同链长及不同硫酸取代形式的寡糖组成。
从HS和肝素的寡糖混合物中分离得到结构确定的寡糖组分具有很大的挑战性。
获得结构确定的HS和肝素寡糖对于研究特定的硫酸化寡糖序列对其生物功能的影响以及开发下一代基于HS的抗凝药物是至关重要的。
HS寡糖已经应用纯化学方法进行合成,然而,由于需要使用复杂的基团保护和去保护作用步骤使化学合成具有一定的难度。
在化学合成方面的发展已经成功的合成了一种具有抗凝血活性的戊糖磺达肝癸钠(Arixtra),然而由于碳水化合物化学合成存在的困难和挑战,通过化学方法合成平均由40个糖单元组成的肝素是不现实的,因为合成中需要准备大量的前体化合物。
因此,HS寡糖的化学合成仅由熟练的合成化学家在少数高度专业化的实验室中完成。
在最近几年,化学酶合成方法利用HS生物合成酶包括糖基转移酶、差向异构酶和硫酸转移酶的高度区域选择性合成HS寡糖已经成为高效合成HS寡糖的主要方法。
化学酶合成方法模拟HS体内生物合成途径合成具有所需生物活性的多种HS 寡糖结构。
然而,由于缺乏对HS合成过程中使用的各种硫酸修饰酶底物特异性的了解使得应用化学酶合成具有特定序列的HS寡糖具有一定的难度。
本论文的另一个重要目标是研究HS生物合成过程中3-O-硫酸转移酶的底物特异性(3-OSTs),包括3-OST-1和3-OST-3,并对其修饰合成的底物的生物学活性进行研究。
本论文的主要研究成果如下:1.建立了一种离线的SAX-ESI-MS/MS分析达肝素钠较短寡糖序列方法我们将离线的强阴离子交换色谱(Strong anion exchange chromatography,SAX-HPLC)与高分辨率高灵敏度的ESI-MS/MS结合分析复杂的达肝素钠较短寡糖混合物。
首先我们通过尺寸排阻色谱(Size exclusion chromatography,SEC)低分辨分离得到达肝素钠较短寡糖然后再应用SAX进行高分辨分离得到每个较短寡糖组分,最后应用ESI-MS/MS对每个寡糖进行序列测定。
应用本实验室开发的快速MS/MS解谱软件对达肝素钠较短寡糖从四糖到八糖的18种代表性组分进行了序列解析。
在本研究中通过ESI-MS/MS分析达肝素钠较短寡糖时发现了一种新型的寡糖结构,即含有2,3-0-硫酸化糖醛酸的达肝素钠六糖。
同时应用肝素酶完全降解和LC-MS/MS分析进一步验证了该新型结构的存在。
本研究方法为LMWHs的结构和肝素降解的反应机制提供了直接和深入的见解,并为进一步表征与蛋白配体相互作用的HS寡糖序列奠定基础。
2.研究3-0-硫酸转移酶(3-OST-1和3-OST-3)的底物特异性并应用化学酶法合成新型的3-O-硫酸化修饰的HS寡糖作为HS寡糖中的一种罕见修饰,3-O-硫酸化的HS寡糖的可获得性是非常受限的。
在本研究中,我们应用结构确定的化学酶合成的HS寡糖作为底物研究3-OST-1和3-OST-3的底物特异性。
我们根据3-OST-1和3-OST-3的底物特异性差异,重新排列酶促反应修饰顺序合成6种新型的3-O-硫酸化的寡糖,包括3种六糖和3种八糖,并对合成的HS寡糖通过HPLC、MS和NMR进行结构验证。
该研究中我们还应用合成的3-O-硫酸化的HS寡糖进一步研究了 3-O-硫酸基团对IdoA2S构象的影响,为了解HS与蛋白配体相互作用的分子机制提供基础。
本方法根据3-OST-1和3-OST-3的底物特异性的差异设计化学酶合成策略进一步扩大3-O-硫酸基团修饰的HS寡糖库,同时对IdoA2S构象变化(1C4和%o)可以调控HS对潜在结合蛋白的选择性进行了深入研究。
3.对3-OST-3修饰合成的HS寡糖进行生物活性研究通过体外和体内生物学实验对3-OST-3修饰合成的寡糖进行生物活性研究。
我们应用Lewis大鼠作为研究对象,分别注射阳性对照磺达肝癸钠(FDA批准的具有抗凝血活性的戊糖)、合成的3-O-硫酸修饰的HS寡糖和阴性对照生理盐水,然后在特定的时间点抽取实验大鼠血液进行抗-FXa活性分析。
同时我们也对合成的3-O-硫酸修饰的HS寡糖进行体外抗-FXa活性测定。
根据生物学活性研究我们发现了一种新型的具有抗凝血活性的3-OST-3修饰合成的八糖,该研究结论与之前报道的3-OST-1修饰的HS寡糖才具有抗凝血活性的结论是矛盾的。