蛋白质的分离与鉴定

四、操作步骤
4.1 植物组织蛋白质提取方法 1）根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取 液，可根据材料不同适当加入），准备提 取液放在冰上。 2）把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后 加入提取液中在冰上静置（2-3小时）。 3）用离心机离心8000rpm 40min 4℃ 或 11100rpm 20min 4℃ 4）提取上清液，样品制备完成。
通过本试验，熟悉蛋白质的提取及检测 方法，尤其可以结合生物化学的方法进行 定性检测。
七、思考题，完成实验报告
1．如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲
反应呈阴性结果，此时可对水解程度作出 什么结论? 2．能否用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的 存在?
1. 材料 植物叶片材料 2. 主要试剂 1、 蛋白质提取液：300mL （1） 1M Tris-HCl（PH8）45mL （2）甘油（Glycerol）75mL （3）聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 2、 10%NaOH溶液。 3、 1％CuSO4。 4、考马斯亮蓝染液300mL
蛋白质的检测 双缩尿法： 取小试管一支，蛋白提Baidu Nhomakorabea液10滴、10％ NaOH溶液5滴及1％硫酸铜溶液1滴，混匀 后，加热。呈紫红色反应，表明有蛋白质 存在。
4.2
五、本实验教学内容的重点和难点
重点：蛋白质的检测
难点：高质量蛋白质的分离、提取；DNA
的污染
六、本实验教学内的深化和拓展
生物技术综合实验
实验二 蛋白质的分离与鉴定
一、目的和要求
1、掌握细胞蛋白质分 离的方法。 2、了解蛋白质的性质。
二、实验原理
1.
蛋白质的提取与纯化
蛋白质是两性电解质，在不同的pH条 件下所带电荷不同。在一定的电场条件下 蛋白质将向与其所带电荷相反的电极方向 移动，移动速率取决于蛋白质表面电荷 的 数量，电压越强或电荷越多则蛋白质移动 的越远。
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子
脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得 到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。 凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键， 或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类 化合物都有双缩脲反应。
考马斯亮蓝法
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中，其
2.
蛋白质检测 A 生物方法：可利用蛋白凝胶单向或双 向电泳检测与分离； 也可以用化学方法分离。
2.
蛋白质检测 B 化学方法： 凯氏定氮法 菲林-酚试剂法 双缩尿法：快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似。 考马斯亮蓝法：较好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 茚三酮反应 硝化反应
双缩尿法
游离态呈棕红色，与蛋白质通过疏水作用 结合后，使染料的最大吸收峰的位置 （lmax），由465nm变为595nm，溶液的 颜色也由棕红色变为兰色。 原理: 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 （特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相 结合。在595nm下测定的吸光度值A595， 与蛋白质浓度成正比
三、材料与试剂