第十六章 沉淀分离法

+ + 中和电荷
+ + + ++ SO42-
_+
+_ +
+ __ _+
中性盐 中和电荷
_ _
_
__
NH4+ _
或Na+
_
_ _
蛋白质沉淀
蛋白质的盐析机制示意图
蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓 度有关，还与离子所带电荷数有关，高价离子影 响更显著。
通常用离子强度表示对盐析的影响。
蛋白质溶解度
6.盐析法的优缺点
（1）优点： ① 室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放
置不会失活，且无机盐不容易引起蛋白质变性失 活；
② 非蛋白的杂质很少被夹带沉淀； ③ 适用范围广，几乎所有蛋白质和酶都能采用 ④ 设备简单，操作方便。
（2）缺点： ① 沉淀物中含有大量盐析剂 ② 硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能
直接加入固体(NH4)2SO4粉末—工业生产
(分批加入，充分搅拌)
加入(NH4)2SO4饱和溶液—实验室和小规模生产
(防止溶液局部过浓，但加量较多时溶液会被稀释)
（三）影响盐析的各种因素
无机盐的加入量 蛋白质的浓度 温度 pH 操作方式
Hale Waihona Puke .无机盐加入量的影响蛋白质溶解度 2.5 2.0 1.5
lgS 1.0 0.5 0 -0.5
常用于生物大分子沉淀的有机溶剂：
甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等， 其中乙醇是工业上最常用的
（二）影响沉淀效果的因素
温度 pH 中性盐浓度 金属离子
1.温度的影响 有机溶剂存在下，多数蛋白质的溶解度随温度 降低而显著的减小，因此低温下（最好低于0oC） 沉淀得完全，有机溶剂用量可减少。
实际操作中： 有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使 溶液的温度显著升高，从而增加对蛋白质的变性 作用。
应用实例-盐析法分离血清中的主 要蛋白质
清蛋白与球蛋白的分离
取100 mL血浆或血清置于500 mL烧杯中，加 PBS缓冲液100 mL搅拌10min
在搅拌下慢慢滴加200 mL pH7.2饱和硫酸铵溶 液
加完饱和硫酸铵溶液后继续搅拌20-30min以充 分沉淀球蛋白
离心（3500 r/min） 20 min，转移上清液（主 要含清蛋白），沉淀中含有各种球蛋白
5.有机溶剂沉淀法的优缺点
（1）优点： ① 乙醇等有机溶剂易挥发除去，不会残留于成
品中，产品更纯净（不需要脱盐处理）； ② 有机溶剂密度低，沉淀物与母液间的密度差
较大，分离容易，适于用离心分离收集沉淀物。
（2）缺点： ① 容易使蛋白质变性，操作需要在低温下进行，
使用上有一定的局限； ② 采用大量有机溶剂，成本较高。 为节省用量，通常将蛋白质溶液适当浓缩，并回
离心（3500 r/min）20 min得上清液（含β-球蛋 白）和沉淀（主要含γ-球蛋白）
取步骤5中上清液在搅拌下，慢慢滴加35-40 mL 饱和硫酸铵溶液，饱和度约达45%
离心（3500 r/min）20 min得上清液（主要为α球蛋白）和沉淀（主要为β-球蛋白）
二、有机溶剂沉淀法
控制pH时应使大多数蛋白质分子带相同电荷， 不要让目的物与主要杂质分子带相反电荷，以免 共沉。
3.无机盐的离子强度
少量的中性盐能够减少蛋白质变性。在有机溶 剂沉淀时中性盐浓度以0.01-0.05 mol/L为宜。
常用中性盐: 乙酸钠、乙酸铵、氯化钠
中性盐浓度较高时（0.2 mol/L以上），由于盐 溶作用会增大蛋白质的溶解度，此时需增加有机 溶剂的用量才能使沉淀析出。
40
蛋白质溶解度
30
lgS 20
C0
10
0 20 30 40 50 60 70 P—不同(NH4)2SO4 饱和度
蛋白质沉淀的速度可用 - —dS 对盐饱和度（P）
作图来表示：
dP
8 – d—S 6
dP 4
利用不同蛋白质盐析分布 曲线在横轴上的位置不同， 可采取先后加入不同量无 机盐的办法来分级沉淀蛋 白质。
0 40 50 60 70 80 P 不同浓度碳氧肌红蛋白的盐析分布曲线
3.温度的影响 低盐浓度：温度升高，溶解度升高 高盐浓度：温度升高，溶解度降低
温度适当提高有利于蛋白质沉淀。 高温容易导致蛋白质变性。 蛋白质盐析一般在室温下进行，某些温度 敏感性的蛋白质盐析最好在低温下进行。
4.pH的影响 蛋白质在pI时的溶解度最小，最容易从 溶液中析出，因此选择在被盐析的蛋白质 的pI附近。
2.5 2.0
1.5 lgS 1.0
0.5
起始蛋白
0
浓度
-0.5
-1.0
-1.5
β
盐溶
碳氧血红蛋白的lgS
与(NH4)2SO4离子强 度μ的关系
S0
盐析
1 234 56 μ(离子强度)
盐析区: lgS = β - Ks μ
蛋白质溶解度 常数 盐析常数 盐离子强度
（二）无机盐的选择
在蛋白质盐析中，常用的盐析剂有(NH4)2SO4,
常见阴离子的盐析作用顺序：
PO43- > SO42- > CH3COO > Cl > NO3 > ClO4 > I > SCN
阳离子对盐析效果的影响：
Al3+ > H+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Cs+ > Rb+ > NH4+ > K+ > Na+ > Li+
无机盐可按两种方式加入溶液中：
温度的控制应根据蛋白质的稳定性而不同，稳 定性较差的物质，冷却至低温是必要的；但对于 稳定性较好的物质，如淀粉酶，温度不需过低， 10-15oC。
2.pH的影响
在等电点时蛋白质溶解度最低，因此有机溶剂 沉淀时溶液pH多控制在蛋白质等电点附近。
pH的控制必须考虑蛋白质的稳定性： 某些酶的等电点在pH4-5之间，比其稳定的pH范 围低，因此pH应首先满足蛋白质稳定性的条件。
一、盐析沉淀法
盐析法：
在高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性 盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。
早在19世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋 白质，目前该方法仍广泛用来回收或分离蛋白 质（酶）等生物大分子物质。
（一）基本原理
蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周 围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。
耗盐少，蛋白质收率也高
5.操作方式的影响
10 固体， 间歇12h
5 酶活性
U/ml 2.5
饱和溶液，
间歇12h
1
50
饱和溶液， 连续12h
饱和溶液， 连续1.6min
60
70 饱和度（%）
操作方式对延胡索酸酶盐析的影响
采用间歇方式所需盐量比连续方式少； 间歇操作中，用饱和溶液的需盐量比用固体盐的高。
2
0 20 30 40 50 60 70 P
蛋白质溶解度随(NH4)2SO4 饱和度而变化的速率
2.蛋白质浓度的影响 蛋白质浓度不同，沉淀所需无机盐用量也不同。 随浓度提高，盐用量减少。
8 – d—S 6
dP 4 2
30g/L
3g/L
分级沉淀： 将溶液稀释，使重 叠曲线拉开距离
制取成品： 提高蛋白质浓度
上清液在搅拌下，慢慢滴加18-25 mL饱和硫酸 铵溶液，饱和度达30-33%
离心（3500 r/min）20 min得上清液（主要含α球蛋白和β-球蛋白）和沉淀（主要含γ-球蛋白和
应用实例-盐析法分离血清中的主 要蛋白质
在搅拌下，慢慢滴加43-50 mL饱和硫酸铵溶液， 约达30-33%饱和度
这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白 质表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以 易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等 参数的影响。
蛋白质在自然环境中通常是可溶的， 表面：大部分是亲水基团 内部：大部分是疏水基团
蛋白质呈稳定 的分散状态
两性物质，一定pH下表面带有一定的 电荷，静电斥力作用使分子间相互排斥
整个操作过程应在低温下进行。 具体操作时： ① 将待分离溶液和有机溶剂分别进行预冷： 蛋白质溶液冷却到0oC左右， 有机溶剂预冷到-10oC以下 ② 为避免温度骤然升高损失蛋白质活力，操作 时应不断搅拌、少量多次加入。 ③ 使沉淀在低温下短时间处理后即进行过滤或 离心分离，接着真空抽去剩余溶液或将沉淀溶入 大量缓冲溶液中以稀释有机溶剂，旨在减少有机 溶剂与目的物的接触。
(NH4)2SO4 70.6 75.4 81.0 88.0 95.3 103
Na2SO4 4.9 18.9 48.3 45.3 43.3 42.2
MgSO4
-- 34.5 44.4 54.6 63.6 70.8
NaH2PO4 1.6 7.8 54.1 82.6 93.8 101
盐析效果：阴离子 > 阳离子 尤其以高价阴离子更为明显。
-1.0 -1.5
β S0
盐析
1 234 56 μ(离子强度)
蛋白质种类不同，盐析所用的无机盐量也不同
蛋白质溶解度 0.50 0
lgS -0.50 -1.00
0 2 4 6 8 10 μ(离子强度)
不同蛋白质溶解度与离子强度的关系
对于特定的蛋白质，一定操作条件下产生沉 淀时的无机盐浓度范围都是一定的，即具有一 定的蛋白质盐析分布曲线。
Na2SO4， MgSO4，NaH2PO4，NaCl， Na3PO4,
K3PO4。 廉价
(NH4)2SO4 原因