第二章 沉淀法..

（3）多价阳离子的作用 蛋白质和多价阳离子（如Zn2+和Cu2+等）能 结合形成复合物，使蛋白质在有机溶剂中的 溶解度降低。这对在高浓度溶剂中才能沉淀 的蛋白质特别有益。 例如，在某些蛋白质溶液中只要加入0.0050.02nmol/L Zn2+，就可大大减少有机溶剂的 用量，而将蛋白质沉淀出来。
三、 蛋白质沉淀剂
四、聚乙二醇沉淀作用

水溶性非离子型聚合物，可使蛋白质发生沉淀作用。
沉淀作用较满意的聚合物是分子量在400-6000之间的聚 乙二醇。 优点：条件温和，不易引起蛋白质变性，沉淀较完全， 应用范围广。 缺点：易受各种因子如pH、离子强度、蛋白质浓度及聚 合物分子量的影响。



五、选择性沉淀法
根据各种蛋白质在不同物理化学因子（如温度、 酸碱度和有机溶剂等）作用下稳定性不同的特 点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变 性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中 （或者发生可逆性沉淀），从而达到纯化有效 成分的目的。

原理：等电点、热变性、酸碱变性和特殊 的可逆沉淀作用 优点：选择性较强，方法简单，种类较多
缺点：应用范围较窄 应用范围：各种生物大分子物质的沉淀



六、 结晶

—改变溶解度产生沉淀的方法
蛋白质沉淀：晶体沉淀和无定形沉淀 结晶过程是纯化过程。在提纯阶段，当某一纯蛋白质 溶液的浓度达到较高（5%-30%）水平时，若条件适合， 就能产生一定形状的结晶。当蛋白质溶液中混有杂质 时，即使条件适合，也得不到整齐的结晶，或无结晶 形成。 用显微镜观察结晶的有无及形状，为判断提纯物质纯 化程度的一种方法。
透析时注意：
（1）透析袋的处理
新的透析袋用蒸馏水洗净，无漏洞时，即可使用。 除去透析袋中所含盐类时，处理方法： 将透析袋置500毫升含1mmo1/L EDTA-Na2的2％碳酸氢钠 溶液中煮沸10分钟，用干净镊子或戴橡皮手套取出，蒸 馏水煮沸、漂洗后，可使用。用过的透析袋同样处理后， 能重复使用。 保存：泡在蒸馏水中置低温（4℃）或泡在70％的乙醇中 保存。
碱性蛋白质 多价阳离子的碱性蛋白质，如鱼精蛋白，除能 有效地沉淀核酸类物质外，还能沉淀某些蛋白 质。 缺点： （1）反应不可逆，应用受到限制 （2）在应用多价阳离子物质时，因其水溶液 pH值为2-3，所以要小心地中和后，再加到蛋 白质溶液中
2．凝集素
植物中特殊的蛋白质，对糖蛋白中糖链的末端糖序列 具有明显、特异的凝集力。
Ka值大，则意味着有效成分溶解度降低的速率 快。 因此，对一种有效成分而言，Ka值越大，分级范 围越窄。盐析效果就越好。 某一蛋白质的Ka值： 与蛋白质本身的性质有关 与溶液的pH、温度和盐的种类等有关
(2)盐的分级范围的差异性 当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白质 的Ka值都很大，而且盐析范围（盐离子强度） 差异明显，则分离效果好；若Ka值很大，但 盐析范围差异较小，则分离效果不好。
V＝需加入硫酸铵溶液的体积（毫升）；V0＝原来溶剂 的体积（毫升）；S1＝原来溶液的百分饱和度；S2＝要 求达到的百分饱和度；S3＝需要加入硫酸铵溶液的饱和 度（一般用100%的）。

优点：比加入固体硫酸铵沉淀法温和。
缺点：对于大体积样品不适用。因为硫酸 铵溶液的大量加入，将导致样品溶液体积 增加。

1. 盐的分级沉淀

（1）盐类的选择 常选用：硫酸铵 优点： a. 溶解度大，对温度不敏感，当水温25℃时， 硫酸铵的饱和溶解度（即每升溶剂可溶解盐 的克数）为769克。当水的温为0℃时，其饱 和溶解度679克。
b. 分级效果好，有些抽提液经过加入适量硫 酸铵的一次性可除杂蛋白75%以上
c. 有稳定蛋白质结构的作用，将2-3mol/L硫酸 铵盐析的蛋白质置低温下保存一年，其性质没 有变化 d. 价格低廉，废液可肥田 缺点：即得到的样品欲继续纯化时，需花一定 时间脱盐
第二节 沉淀的类型与操作
一、盐析法
原理：是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓 度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到 一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白 质析出（盐析）。
原因：盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低， 导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜 逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集 并从溶液中析出。
（1）盐析常数（Ka） 蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度 的关系为：溶解度（S，以mg/ml表示）的对 数值与溶液中盐的浓度（M）成反比例关系， 可用公式表示： lgS＝β-Ka·M 式中β表示有效成分在水中溶解度的对数值；M 表示克分子浓度； Ka表示有效成分在特定条 件下的数值，即表示有效成分的溶解度降低 的速率是随着盐浓度的增加而增加的。

如此连续进行，便可得到6-10个分级沉淀部分。 然后将每个分级沉淀部分分别重新溶解于一定体 积的适宜pH的缓冲液中，根据其蛋白质或酶含量 和相对应的硫酸铵浓度之间的关系作图，即可得 到典型盐析曲线。 在此曲线基础上，参照分级试验方法，可找出有 利于提高收得率和纯化倍数的精细盐析范围。

3. 盐析的影响因子

③ 透析盐析法
将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积 盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液中的 盐浓度。
特点：盐浓度是以连续的状态变化，可以避免盐 浓度局部升高产生的不良影响，分离效果好。 缺点：只用于要求较精确、样品体积小的试验。
2．盐析曲线的制作 用盐析法沉淀欲分离样品时所需盐浓度范围要通 过实验确定。 具体步骤： 取一定体积已测含量的蛋白质或酶待分离溶液， 调节pH至稳定范围，分6-10次加入不同量的硫 酸铵：第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊状 态时，静置一段时间，离心或过滤即得到第一 个分级沉淀部分。接着以同样的操作加硫酸铵 到上清液或过滤液中，则得到第二个分级沉淀 部分。



对难结晶的物质，有时采用加入少量 “晶种”引子，或进行适当搅拌，或在 容器壁上用玻棒轻轻摩擦等办法，对结 晶形成有加速作用。
例如，伴刀豆球蛋白与含有葡萄糖、甘露糖等分子的 糖蛋白能发生特异的凝集沉淀作用，通过离心操作可 把糖蛋白和一般蛋白质分开，获得的凝集素-糖蛋白复 合物用单糖作抑制剂就能使其解离。 优点：反应条件较温和，专一性强
3．重金属 重金属盐如铅盐、汞盐作为蛋白质沉淀剂能使 蛋白质或酶纯化。 重金属会使蛋白质变性，因此控制在较温和的 条件下进行，并要及时通过透析方法把蛋白质 和重金属尽快分开。
需要指出：
（1）低温下操作
由于有机溶剂加入水溶液时产生放热反应会引 起蛋白质变性 有机溶剂预冷至-10℃，在低温下进行
（2）中性盐的作用
少量的中性盐能增加蛋白质在有机溶剂中的溶 解度，降低有机溶剂对蛋白质的变性作用，提 高分级效果。
若加入过多，可引起蛋白质析出，影响有机溶 剂的分级作用。 中性盐的离子强度在0.05以下时，能防止蛋白 质变性。用有机溶剂沉淀蛋白质时，宜在稀盐 溶液或低浓度缓冲液中进行。
盐脱是否彻底，要经常检查：
除去硫酸铵，可用10%氯化钡检查 除去氯化钠，可用10％硝酸银检查 透析液中检测不出现硫酸钡或氯化银沉淀， 即透析完成。
二、有机溶剂沉淀法
有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因：
（1）与盐溶液一样具有脱水作用 （2）有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂 的极性减小
常用的有机溶剂：甲醇、乙醇和丙酮
（2）硫酸铵盐析的操作 ① 固体加入法：在溶液中逐步加入固体硫酸 铵，加到一定饱和度时，蛋白质可沉淀出 来。
注意：控制加入的速度，在搅拌下、以少 量多次方式缓慢地加入，待先加的硫酸铵 溶解后再加入少量的硫酸铵。
② 饱和溶液加入法

是使蛋白质脱水沉淀比较温和的方法
蛋白质溶液中逐步加入预先调好pH的饱和硫酸铵溶液， 不同饱和度所需的硫酸铵量可用计算：
用有机溶剂沉淀蛋白质，需加入的有机溶剂量，一般 以体积为单位计算：
V＝需加入有机溶剂的体积 V0＝蛋白溶液的原始体积 S1＝蛋白溶液中有机溶剂的浓度(体积百分浓度) S2＝蛋白溶液中欲达到的溶剂浓度(体积百分浓度) 如果使用的有机溶剂含量不是100％而是95%，则公式中 的100应改95，余此类推。
(3) pH和盐浓度

溶解度与pH和盐浓度有密切关系。当这两种因 子变动时，溶解度将发生明显的变化。 选择适当pH的盐溶液，可提高对有效成分的盐 析效果。 另外，硫酸铵水溶液显酸性，为防止其对某些 蛋白质的破坏，应及时用氨水调pH至中性或视 有效成分的pH而定。


(4) 蛋白质的纯度和浓度

蛋白质存在的形式和浓度不同，盐析范围和溶 解度也不同。 在混合的蛋白质溶液中，不同分子间的相互作 用会发生共沉淀现象。蛋白浓度越高，这种现 象越明显，盐析分离效果则越差。
因此，一般控制样品液蛋白浓度在0.2

在溶液中加1mmo1/L的EDTA-Na2盐，以除去沉 淀剂中带入的金属离子。 或控制加硫酸铵沉淀的时间，一般二小时左右。

4．脱盐
常用方法：凝胶过滤法和透析法 具体操作：是把待脱盐溶液装入有一定孔径的透析袋，扎紧袋 口（袋内留适当的空间）。漂在水或适当的透析液中。要防 止透析液从袋口进入，以免引起透析袋胀裂。 盐离子和小分子物质将穿过半透膜由高向低进行扩散渗透，而 蛋白质等则留在袋内。 不断更新透析液，若用温和搅动的办法则效果较好；为了避免 蛋白质或酶类破坏，在低温下进行。
第二章 沉淀法
沉淀法（溶解度法）—是纯化生物大分子物 质常用的一种经典方法
优点：操作简单，成本低廉
分类：盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性沉淀
第一节 基本原理
原理： 根据各种物质的结构差异性（如蛋白质 分子表面疏水性基团和亲水基团之间的 差异性）来改变溶液的某些性质（如pH、 极性、离子强度、金属离子等），进而 导致有效成分的溶解度发生变化。
一般操作步骤（蛋白质分级沉淀时常用）