第二章沉淀法52
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沉淀法
一些盐类对碳氧血红蛋白的盐析常数：
（二）、pH和温度的影响
ß 值与蛋白质种类关系较大，但和
盐的种类基本上无关系，而和pH与 温度有关。
通常ß 在等电点附近有极小值，蛋
白质的相对溶解度随pH变化很大。
在高浓度盐的溶液中，蛋白质的溶解度随温度升高而减小。
图中直线都 相互平行，说明 Ks不随PH和温度 而变。
盐析法制得的蛋白质，用有机溶剂沉淀法进
一步精制时，事先必须经过透析。
11、多价阳离子（Ca2＋, Zn2＋）会与蛋白质形成
复合物，这种复合物在水或有机溶剂中的溶解度较低，
因而，可以降低使蛋白质沉淀的有机溶剂浓度，这对于 分离那些在有机溶剂—水溶液中有明显溶解度的蛋白质 来说，是一种较好的方法。
四、非离子型聚合物沉淀法
第四节、 蛋白质沉淀方法
根据所加入沉淀剂的不同来进行分类，包括：
① ② ③ ④ ⑤ ⑥
加入中性盐盐析； 加入可溶性有机溶剂； 将pH值调节到等电点； 加入非离子型亲水性聚合物； 加入聚电解质絮凝； 加入多价金属离子等。
选择方法时，应考虑的因素：
沉淀剂是否会引起蛋白质分子的破坏 沉淀剂本身的性质 沉淀操作的成本和难易程度
盐析的原因：
中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性，加入大 量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水 区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分 子即形成沉淀。
二、等电点沉淀法
两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生
沉淀，从而实现分离。 氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以 利用此法进行初步的沉淀分离。
影响Ks的因素： Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关， 但这种变化不是很大。 例如：以硫酸铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白 质来说其变化不会超过1倍。
第二章 沉淀法
法。
7、沉淀法的优缺点
优点：操作简单、经济、浓缩倍数高。 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、
选择性不强。
8、沉淀法的分类
根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法；
（4）亲和沉淀法；
（5）选择性沉淀法。 （6）复合盐沉淀法； （7）非离子型聚合物沉淀法； （8）聚电解质沉淀法；
对起始浓度为 30g/L的COMb溶液，大部分蛋白质在硫
酸铵饱和度为 58-65％之间沉淀出来； 但对稀释10倍的 COMb溶液，饱和度达到66%时才开始 沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。
11、盐析注意事项
选择适宜饱和度 采用分步盐析 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH 用磷酸
二、蛋白质的溶解特性
蛋白质是由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成的 两性高分子电解质，形成荷电区。 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向 内部折叠的趋势，形成疏水区。疏水性氨基酸含量 高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。
亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面， 形成亲水区。
因此，蛋白质由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、 亲水区和疏水区。
三、盐析
Salt induced precipitation
1、定义
概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等 生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉 淀的过程。 盐析是可逆的，而变性是不可逆的
早在1859年，中性盐盐析法就用于从血液中分离蛋 白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级 中使用，得到了比较满意的结果。
盐析注意事项
硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有 敏感作用，使用前用H2S处理 高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（pH=5.0左右），使 用前也需要用氨水调节至所需pH。 硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意 固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化 已考虑在表中； 盐析后一般放臵半小时至一小时，待沉淀完全后才过 滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种 情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心 速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较 低浓度硫酸铵溶液。
7、沉淀法的优缺点
优点：操作简单、经济、浓缩倍数高。 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、
选择性不强。
8、沉淀法的分类
根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法；
（4）亲和沉淀法；
（5）选择性沉淀法。 （6）复合盐沉淀法； （7）非离子型聚合物沉淀法； （8）聚电解质沉淀法；
对起始浓度为 30g/L的COMb溶液，大部分蛋白质在硫
酸铵饱和度为 58-65％之间沉淀出来； 但对稀释10倍的 COMb溶液，饱和度达到66%时才开始 沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。
11、盐析注意事项
选择适宜饱和度 采用分步盐析 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH 用磷酸
二、蛋白质的溶解特性
蛋白质是由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成的 两性高分子电解质，形成荷电区。 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向 内部折叠的趋势，形成疏水区。疏水性氨基酸含量 高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。
亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面， 形成亲水区。
因此，蛋白质由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、 亲水区和疏水区。
三、盐析
Salt induced precipitation
1、定义
概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等 生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉 淀的过程。 盐析是可逆的，而变性是不可逆的
早在1859年，中性盐盐析法就用于从血液中分离蛋 白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级 中使用，得到了比较满意的结果。
盐析注意事项
硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有 敏感作用，使用前用H2S处理 高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（pH=5.0左右），使 用前也需要用氨水调节至所需pH。 硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意 固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化 已考虑在表中； 盐析后一般放臵半小时至一小时，待沉淀完全后才过 滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种 情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心 速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较 低浓度硫酸铵溶液。
2011第二章沉淀法(52)
3. 影响盐析因素
4）蛋白质的纯度和浓度 ） 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量， 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓 度过高，会发生严重共沉淀作用， 度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的 效果会明显下降。 效果会明显下降。 在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多， 在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多， 共沉淀作用比较少，但回收率会降低。 共沉淀作用比较少，但回收率会降低。 一般0.2%～ 2% 的蛋白质浓度比较适中。 的蛋白质浓度比较适中。 一般 ～ 5）其他 ） 处理。 金属离子——用EDTA-Na2 处理。 金属离子 用 硫酸铵沉淀时间要合适。 硫酸铵沉淀时间要合适。
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 10 20 30 35 40 50 60 65 70 80 saturation of ammonium sulphate, %
增强绿色荧光蛋白eGFP的硫酸铵盐析曲线（沉淀） 的硫酸铵盐析曲线（沉淀） 增强绿色荧光蛋白
2. 盐析曲线制作
protein relative content in supernatant ) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 60 80 100 ％ of saturation of ammonium sulphate
4. 脱盐
凝胶过滤层析 透析——分子扩散运动 透析 分子扩散运动 使用透析袋时， 使用透析袋时，盐与 小分子物质将会穿过半透 膜由高浓度向低浓度进行 渗透扩散， 渗透扩散，而大分子物质 则会留在袋内。 则会留在袋内。 样品液与透析液体积 比一般为1:10。 比一般为 。
纯化方法
分离纯化： 除去各种杂质， 分离纯化 ： 除去各种杂质 ， 获得较高纯 度物质的过程。 度物质的过程。 蛋白质和酶分离提纯方法： 沉淀分离、 蛋白质和酶分离提纯方法 ： 沉淀分离 、 层析分离、电泳分离、超离心分离等。 层析分离、电泳分离、超离心分离等。
第二章沉淀法
第二章沉淀法
常用有机溶剂： 苯酚、氯仿 为蛋白质的一类变性剂。
常用蛋白质水解酶： 溶菌酶、蛋白酶K、蛋白酶E
第二章沉淀法
(1)去污剂
在破细胞的溶液中， ➢ 加入适量的阴离子去污剂 SDS或其他去污剂,有利于使膜蛋白
和脂肪溶解，将DNP／RNP复合物解聚，进而释放出核酸。 ➢ 随后加入适量的乙酸钾溶液，以沉淀核酸抽提液中的SDS-蛋
④蛋白质的纯度和浓度
一般控制样品液蛋白浓度在0.2％—2％为宜。 (蛋白质浓度越高，共沉淀现象越明显）
第二章沉淀法
⑤其他
在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加 1mmol／L的EDTA-Na2盐，以除去沉淀剂中带 入的金属离子。
再者是加硫酸铵沉淀的时间要控制好，过长 过短都不适宜，一般需要2h左右。
第二章沉淀法
以下优点： 溶解度大，对温度不敏感。 分级效果好。有稳定蛋白质结构的作用。 价格低廉，废液可以肥田。
缺点：得到的样品欲继续纯化时，需花一定时 间脱盐。
第二章沉淀法
②硫酸铵盐析
A．固体法 在大体积的粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，当加
到一定饱和度时，蛋白质便可沉淀出来。 例如，在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度
第二章沉淀法
盐析小结
A.分级沉淀； B.作图盐析曲线：
测蛋白质或酶含量；作盐析曲线图（以蛋白质或酶含 量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系）； C.确定最佳盐析范围： 反复试验，确定最佳盐析范围（材料来源的难易，有 效成分纯度和收得率的需求）。
第二章沉淀法
(3)盐析的影响因子
①盐析常数(KS)
白质及SDS-K+等物质； ➢ 接着可采用离心方法将沉淀物除去，上清液即为初步纯化的
核酸制品。
常用有机溶剂： 苯酚、氯仿 为蛋白质的一类变性剂。
常用蛋白质水解酶： 溶菌酶、蛋白酶K、蛋白酶E
第二章沉淀法
(1)去污剂
在破细胞的溶液中， ➢ 加入适量的阴离子去污剂 SDS或其他去污剂,有利于使膜蛋白
和脂肪溶解，将DNP／RNP复合物解聚，进而释放出核酸。 ➢ 随后加入适量的乙酸钾溶液，以沉淀核酸抽提液中的SDS-蛋
④蛋白质的纯度和浓度
一般控制样品液蛋白浓度在0.2％—2％为宜。 (蛋白质浓度越高，共沉淀现象越明显）
第二章沉淀法
⑤其他
在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加 1mmol／L的EDTA-Na2盐，以除去沉淀剂中带 入的金属离子。
再者是加硫酸铵沉淀的时间要控制好，过长 过短都不适宜，一般需要2h左右。
第二章沉淀法
以下优点： 溶解度大，对温度不敏感。 分级效果好。有稳定蛋白质结构的作用。 价格低廉，废液可以肥田。
缺点：得到的样品欲继续纯化时，需花一定时 间脱盐。
第二章沉淀法
②硫酸铵盐析
A．固体法 在大体积的粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，当加
到一定饱和度时，蛋白质便可沉淀出来。 例如，在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度
第二章沉淀法
盐析小结
A.分级沉淀； B.作图盐析曲线：
测蛋白质或酶含量；作盐析曲线图（以蛋白质或酶含 量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系）； C.确定最佳盐析范围： 反复试验，确定最佳盐析范围（材料来源的难易，有 效成分纯度和收得率的需求）。
第二章沉淀法
(3)盐析的影响因子
①盐析常数(KS)
白质及SDS-K+等物质； ➢ 接着可采用离心方法将沉淀物除去，上清液即为初步纯化的
核酸制品。
《物质的分离》PPT课件(完美版)
操作注意点：
（1）温度计下端玻璃泡位于蒸馏烧瓶的支管口处。 （2）蒸馏烧瓶中加入碎瓷片，以防暴沸。 （3）石棉网的作用是使烧瓶受热均匀。 （4）冷凝管中水流方向：自下而上，使冷却更充分。 （5）蒸馏法的应用：海水中提取淡水。
《物质的分离》PPT课件
《物质的分离》PPT课件
把水加热至沸腾，产生的水蒸气经冷却形成液 态水的方法称为蒸馏法。用这种方法收集到的 水就是蒸馏水。
制作《净水器》
①活性炭净水器 ②简易净水器 2、河水过滤后，滤液可以喝吗？ 不能，因为过滤不能去除可溶的杂质及微生物
《物质的分离》PPT课件
《物质的分离》PPT课件
鲁滨逊利用自制的过滤柱过滤泥水， 然后把已经过滤的水煮沸。
但水仍非绝 对安全饮用
鲁滨逊制取的水可以喝吗？
《物质的分离》PPT课件
《物质的分离》PPT课件
从漏斗中取出滤纸，细心观察，滤纸上留下了什 么？泥浆水发生了什么变化？
《物质的分离》PPT课件
《物质的分离》PPT课件
想一想：
1、过滤后，滤液仍然浑浊 可能的原因有那些？
(1)滤纸破损 (2)滤液边缘高于滤纸边缘 (3)仪器不干净等 应该再过滤一次，直到澄 清为止。
《物质的分离》PPT课件
《物质的分离》PPT课件
《物质的分离》PPT课件
《物质的分离》PPT课件
沉淀法：使水中的杂质沉淀到水底的方法。
原理 根据物质的溶解性不同
适用范围： 用于分离液体中有混合 的不溶性的固体杂质
凝聚剂的作用： 使水中的悬浮杂质凝聚成一些较大的 颗粒并慢慢沉到水底
明矾是一种凝聚剂
《物质的分离》PPT课件
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二低
①滤纸边缘低于漏斗边缘
（1）温度计下端玻璃泡位于蒸馏烧瓶的支管口处。 （2）蒸馏烧瓶中加入碎瓷片，以防暴沸。 （3）石棉网的作用是使烧瓶受热均匀。 （4）冷凝管中水流方向：自下而上，使冷却更充分。 （5）蒸馏法的应用：海水中提取淡水。
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把水加热至沸腾，产生的水蒸气经冷却形成液 态水的方法称为蒸馏法。用这种方法收集到的 水就是蒸馏水。
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①活性炭净水器 ②简易净水器 2、河水过滤后，滤液可以喝吗？ 不能，因为过滤不能去除可溶的杂质及微生物
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鲁滨逊利用自制的过滤柱过滤泥水， 然后把已经过滤的水煮沸。
但水仍非绝 对安全饮用
鲁滨逊制取的水可以喝吗？
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1、过滤后，滤液仍然浑浊 可能的原因有那些？
(1)滤纸破损 (2)滤液边缘高于滤纸边缘 (3)仪器不干净等 应该再过滤一次，直到澄 清为止。
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沉淀法：使水中的杂质沉淀到水底的方法。
原理 根据物质的溶解性不同
适用范围： 用于分离液体中有混合 的不溶性的固体杂质
凝聚剂的作用： 使水中的悬浮杂质凝聚成一些较大的 颗粒并慢慢沉到水底
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二低
①滤纸边缘低于漏斗边缘
第2章 沉淀法..
2018/9/14
海南大学农学院wss10
4)非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分
子。
5)生成盐复合物沉淀：用于多种化合物，特
别是某些小分子物质的沉淀。
6)热变性及酸碱变性沉淀法：即选择性变性
沉淀。在分离制备时，选择性的用于除去
某些不耐热及在一定pH值下易变性的杂蛋 白。
2018/9/14
海南大学农学院wss11
一般控制样品液蛋白浓度在0.2%～2％为宜。 长短的控制。
5.其他： 如 EDTA、EGTA等金属离子螯合剂; 时间
2018/9/14
海南大学农学院wss39
（六）脱盐
方法：凝胶过滤法
透析法
透析法的原理是基于分子的扩散运动，具体操
3.为保证实验的重复性，应严格控制盐析条件的 pH、温度和盐的纯度。
4.盐析后需静置1小时以上沉淀完全后才进行过 滤或离心。
5.盐析时的搅拌必须是有规则的和温和的。 6.为平衡硫酸铵溶解时产生的轻微酸化作用，沉 淀反应至少应在50 mmol/L缓冲液中进行。
2018/9/14 海南大学农学院wss35
2018/9/14 海南大学农学院wss37
2.盐分级范围的差异性 与蛋白质的盐析分离效果
沉淀量/mg
A
B
C
30
2018/9/14
40
50
60
70
80
90 硫酸铵饱和度/％
海南大学农学院wss38
3.pH和盐浓度
在pI附近可用合适的盐浓度改变蛋白质的溶解度。
4.蛋白质的纯度和浓度
蛋白质存在的形式（均一的还是混合的）和浓度不 同，盐析范围和溶解度也不同。 蛋白质浓度高时共沉淀明显，盐析效果差。
2.2 沉淀和沉淀池
第二章污水的物理处理城市污水处理系统构成出水进水污泥消化池浓缩池二沉池生物池初沉池沉砂池格栅脱水车间处置污泥回流剩余污泥鼓风机内回流沼气利用一级处理二级处理（物理处理）（生物处理）√√√√第二节沉淀和沉淀池•沉淀就是利用重力沉降将比水重的悬浮颗粒从水中去除的操作。
主要是有机悬浮物•沉淀是废水处理用途最广泛的单元操作之一。
•沉淀池是分离悬浮颗粒的一种主要处理构筑物。
沉淀池三种流态平流式竖流式辐流式沉淀池功能分区•每种沉淀池均包括进水区、沉淀区、出水区、污泥区和缓冲区5个功能区。
–进水区和出水区的作用是进行配水和集水，使水流均匀地分布，提供尽可能稳定的水力条件。
–沉淀区是可沉颗粒与水分离的区域。
–污泥区是泥渣贮存、浓缩和排放的区域。
–缓冲区是分隔沉淀区和污泥区的水层，防止泥渣受水流冲刷而重新浮起。
沉淀池设计计算的一般规定1)设计流量应按分期建设最大设计流量计算；–在合流制处理系统中，应按降雨时的设计流量计算，沉淀时间不宜小于30分钟。
2)沉淀池的个数或分格数n≧2个，并宜按并联系列设计。
3)当无实测资料时，城市污水沉淀池的设计数据可参照有关手册选用，工业废水沉淀池的设计数据应按实际水质试验确定，或参照类似工业废水的运转或试验资料采用。
4)池子的超高h≧0.3m。
15)一般沉淀时间t ≧ 1.0h；有效水深h=2～4m，对辐流沉淀池指池边水深。
2沉淀池的表面负荷一定时，有效水深与沉淀时间之比亦为定值，即H/t＝q 6)沉淀池缓冲层高度h= 0.3～0.5m。
47)污泥斗斜壁与水平面的倾角，方斗不宜小于60°，圆斗不宜小于55°8)排泥管直径D ≧ 200mm。
9)机械排泥可连续或间歇排泥。
不用机械排泥时应每日排泥，初次沉淀池的静水头≧1.5m（HO）；二次沉淀池的静水头，生物膜法后≧1.2m，2曝气池后≧0.9m。
10)采用多斗排泥时，每个泥斗均应设单独的闸阀和排泥管。
11)当每组沉淀池有2个以上时，为使每个池的入流量均等，应在入流口设置调节阀门，以调整流量。
沉淀法与吸附法PPT讲稿
温度无关。
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色散力：是非极性分子之间的引力，当分子外围电子运动 及原子核在零点附近震动，正负电荷中心出现瞬
时相对位移时，产生快速变化的瞬时偶极矩，能
使外围非极性分子极化，反过来又影响瞬时偶极
矩的变化而产生这种色散力。与温度无关。
➢ 此外，还有氢键力，这是介于库仑引力和范德华力之间的定
logS＝β-Ks• m
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盐析机理示意图
当前你正在浏览到的事第六页PPTT，共四十三页。
当前你正在浏览到的事第七页PPTT，共四十三页。
当前你正在浏览到的事第八页PPTT，共四十三页。
➢ 盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白
质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋 白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；
当前你正在浏览到的事第十五页PPTT，共四十三页。
温度的影响
升温，可增加许多无机盐 和小分子有机物的溶解度。
但在高盐浓度中，蛋白质
等生物大分子物质的溶解 度随温度的升高反而减小。
当前你正在浏览到的事第十六页PPTT，共四十三页。
pH对β的影响
盐析pH的选择要以不 降低产物的活性为原则。 由于蛋白质在等电点时 最易沉淀，可选择等电 点的pH作为盐析的pH
向力，比诱导力和色散力都大。
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(二)吸附类型
1、物理吸附： 吸附剂和吸附物通过分子间的引力产生的吸附。
特点：
➢ 吸附作用不仅局限于活性中心，而是整个自由界面；
➢ 分子被吸附后，一般动能降低，所以吸附是放热反应； ➢ 物理吸附的吸附热较小，吸附物分子的状态变化不大，所
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色散力：是非极性分子之间的引力，当分子外围电子运动 及原子核在零点附近震动，正负电荷中心出现瞬
时相对位移时，产生快速变化的瞬时偶极矩，能
使外围非极性分子极化，反过来又影响瞬时偶极
矩的变化而产生这种色散力。与温度无关。
➢ 此外，还有氢键力，这是介于库仑引力和范德华力之间的定
logS＝β-Ks• m
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盐析机理示意图
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➢ 盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白
质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋 白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；
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温度的影响
升温，可增加许多无机盐 和小分子有机物的溶解度。
但在高盐浓度中，蛋白质
等生物大分子物质的溶解 度随温度的升高反而减小。
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pH对β的影响
盐析pH的选择要以不 降低产物的活性为原则。 由于蛋白质在等电点时 最易沉淀，可选择等电 点的pH作为盐析的pH
向力，比诱导力和色散力都大。
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(二)吸附类型
1、物理吸附： 吸附剂和吸附物通过分子间的引力产生的吸附。
特点：
➢ 吸附作用不仅局限于活性中心，而是整个自由界面；
➢ 分子被吸附后，一般动能降低，所以吸附是放热反应； ➢ 物理吸附的吸附热较小，吸附物分子的状态变化不大，所
第2章沉淀法1
常用于分离大小和密度相差较大的颗粒。
2.密度梯度离心
原理：样品在密度梯度介质中进行离心，使沉 降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方 法。
每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质 密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管 中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以 在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。
酵母干粉＋磷酸氢二钠
37℃，2小时
室温搅拌3小时
离心收集上清液 55℃，20分钟，迅速冷却
离心得上清
热稳定的醇脱氢酶溶液。
6． 结晶沉淀法
蛋白质沉淀：晶体沉淀 无定形沉淀(非晶体)
当某一纯蛋白质溶液的浓度达到较高(5%-30％)水 平时．只要条件适合，就能产生一定形状的结 晶。当蛋白溶液中混有杂质时，即使条件适合、 也得不到整齐的结晶，或无结晶形成。
① 低温操作 有机溶剂预冷至一10℃，操作在低温进行。
② 中性盐的作用 宜在稀盐溶液或低浓度缓冲液中进行。
③ 多价阳离子的作用 有些蛋白质和多价阳离子(如Zn2+、Cu2+等) 能结合形成复合物，致使蛋白质在有机溶 剂中的溶解度降低。
3． 蛋白质沉淀法
(1) 碱性蛋白质 如：鱼精蛋白 (2) 凝集素 如：植物凝集素 (3) 重金属
4． 聚乙二醇沉淀法
聚乙二醇〔ployethylene glycol, PEG〕和 右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合 物可使蛋白质发生沉淀作用。
沉淀条件温和，不易引起蛋白质变性，而 且沉淀较完全，因此应用范围颇广。
但是，它也受各种因子如pH、离子强度、 蛋白质浓度以及聚合物分子量的影响。
5． 选择性沉淀法
• 盐析(salting-out effect)：当盐浓度增高 到一定数值时，蛋白质溶解度又逐渐下 降，直到蛋白质析出。
2.密度梯度离心
原理：样品在密度梯度介质中进行离心，使沉 降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方 法。
每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质 密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管 中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以 在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。
酵母干粉＋磷酸氢二钠
37℃，2小时
室温搅拌3小时
离心收集上清液 55℃，20分钟，迅速冷却
离心得上清
热稳定的醇脱氢酶溶液。
6． 结晶沉淀法
蛋白质沉淀：晶体沉淀 无定形沉淀(非晶体)
当某一纯蛋白质溶液的浓度达到较高(5%-30％)水 平时．只要条件适合，就能产生一定形状的结 晶。当蛋白溶液中混有杂质时，即使条件适合、 也得不到整齐的结晶，或无结晶形成。
① 低温操作 有机溶剂预冷至一10℃，操作在低温进行。
② 中性盐的作用 宜在稀盐溶液或低浓度缓冲液中进行。
③ 多价阳离子的作用 有些蛋白质和多价阳离子(如Zn2+、Cu2+等) 能结合形成复合物，致使蛋白质在有机溶 剂中的溶解度降低。
3． 蛋白质沉淀法
(1) 碱性蛋白质 如：鱼精蛋白 (2) 凝集素 如：植物凝集素 (3) 重金属
4． 聚乙二醇沉淀法
聚乙二醇〔ployethylene glycol, PEG〕和 右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合 物可使蛋白质发生沉淀作用。
沉淀条件温和，不易引起蛋白质变性，而 且沉淀较完全，因此应用范围颇广。
但是，它也受各种因子如pH、离子强度、 蛋白质浓度以及聚合物分子量的影响。
5． 选择性沉淀法
• 盐析(salting-out effect)：当盐浓度增高 到一定数值时，蛋白质溶解度又逐渐下 降，直到蛋白质析出。
第二章 沉淀法汇总
P2、P1为初始和最终溶液的饱和度
X为1L溶液所需加入的硫酸铵的克数
（2）查表法
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
B.饱和溶液法 这是一种使蛋白质脱水沉淀比较温
和的力法。其操作是在蛋白质溶液中逐步加人预先调好pH的 饱和硫酸铵溶液，不同饱和硫酸铵溶液，不同饱和度所需的 硫酸铵的量可用下列公式表示：
V＝V0
1. 盐析法
(1) 盐分级沉淀 (2) 盐析曲线制作 (3) 盐析的影响因子 (4) 脱盐
(1)盐分级沉淀
①盐的选择：常选用硫酸铵,其优点：
a.溶解度大，对温度不敏感.(水的温度=25℃，硫酸铵的饱和溶解度=769g,当水
的温度=0℃时，其饱和溶解度高=679g,这是其他盐类所不具备的。)
b.分级效果好.有些抽提液经过加适量硫酸铵的一步分级沉淀处理后，就可除去杂蛋
（一）盐析法
原理：高浓度中性盐存在下，使生物分子在水溶液中溶解 的溶解度降低而产生沉淀的方法，多用于蛋白质（酶）的 分离。
常用的盐类是硫酸铵。 优点：
①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
盐析机制
①盐溶：[盐]低时，S（蛋白质的溶解度）随[盐]增加而 增加； ②盐析：[盐]高时，S（蛋白质的溶解度）随[盐]增加而 降低；
(2)凝集素：为一种特殊的蛋白质，对糖蛋白中糖链的末端序 列具有明显、特异的凝集力。如伴刀豆球蛋白与含有葡萄糖、 甘露糖等分子的糖蛋白能发生特异的凝集沉淀作用，通过离心 操作可把糖蛋白和一般蛋白质分开，再用单糖作抑制剂就能使 其解离。该沉淀法反应条件较温和，专一性强。
常用有机溶剂：乙醇、甲醇、丙酮等。
优点： ①分辨能力比盐析法高，一种溶质只在一个比较窄的有机溶 剂范围内沉淀； ②沉淀不需脱盐； ③有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，容易进行固液分离； ④有机溶剂容易蒸发，不会在成品中残留，适用于食品、药 品的制备。
第二章 沉淀法
沉淀法
3.1.3 加蛋白水解酶
• 溶菌酶、蛋白酶K、蛋白酶 溶菌酶、蛋白酶 、蛋白酶E • 蛋白酶 中含DNase，用前 °C，5min，或 蛋白酶E中含 中含 ，用前80° ， ， 37°C温育 温育0.5~1hr. ° 温育
沉淀法
3.2 消除多糖杂质
• 选用选择型沉淀剂：异戊醇、十六烷基三甲基溴 选用选择型沉淀剂：异戊醇、 化铵（ 化铵（CTAB)
沉淀法
制备蛋白质（蛋白质沉淀） 第二节 制备蛋白质（蛋白质沉淀）
2.1 盐析法 2.1.1 机理 盐溶：蛋白质在稀盐溶液中， 盐溶：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度随盐浓度的增 高而上升的现象。 高而上升的现象。
沉淀法
• 盐析：当盐浓度增高到一定值时，蛋白质的溶解 盐析：当盐浓度增高到一定值时， 度逐渐下降，直至蛋白质析出。 度逐渐下降，直至蛋白质析出。
沉淀法
C、蛋白质纯度和浓度的影响： 、蛋白质纯度和浓度的影响： D、其他因素的影响： 、其他因素的影响： 金属离子： 金属离子：加EDTA－Na2溶液 － 时间： 加（NH4)2SO4时间：2hr加完 加完
沉淀法
5) 脱盐
• 凝胶过滤法： 凝胶过滤法： • 透析法： 透析法： 透析方法： 透析方法： 搅拌下， 平衡， 搅拌下，3hr平衡，样品液：透析液＝1:10； 平衡 样品液：透析液＝ ； 或静止，过夜，样品液：透析液＝ 或静止，过夜，样品液：透析液＝1:20。 。
阳离子去污剂： 阳离子去污剂：SDS 其他去污剂：十二烷基肌氨酸钠、 其他去污剂：十二烷基肌氨酸钠、DOC、Triton X 、 －100、Tween 40 、
沉淀法
3.1.2 加有机溶剂
• 机理：加入苯酚、氯仿等蛋白质变性剂，反复抽 机理：加入苯酚、氯仿等蛋白质变性剂， 上层水相即为核酸制品。 提，上层水相即为核酸制品。 • 操作注意： 操作注意：
滴定分析方法及应用沉淀滴定法共52页文档
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到、没有人陪你走一辈子，所以你要 适应孤 独，没 有人会 帮你一 辈子， 所以你 要奋斗 一生。 22、当眼泪流尽的时候，留下的应该 是坚强 。 23、要改变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之 首，因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿． 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ，它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ，以便 让别一 只脚能 够再往 上登。
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
沉淀法2
选择性变性沉淀 法
选择性变性沉淀法是使杂质变性沉淀，又对目的 选择性变性沉淀法是使杂质变性沉淀， 杂质变性沉淀 物没有明显影响， 物没有明显影响，所以在操作之前要对欲分离的 物质中的杂蛋白等杂质的种类、 物质中的杂蛋白等杂质的种类、含量及其物理化 学性质等有比较全面的了解。 学性质等有比较全面的了解。
化学反应结晶
• 加入反应剂或调节PH生成一种新的溶解 度更低的物质，当其浓度超过溶解度时， 晶体析出。
解析法
• 向溶液中加入某些物质，使溶质的溶解 度降低，形成过饱和溶液而结晶析出。 • 盐析结晶法 • 有机溶剂结晶法 • 水析结晶法
结晶的操作事项调整溶液的性质和环境条件尽可能多的溶质分子相互碰撞形成结晶结晶的过程?过饱和溶液的形成?晶核的形成?晶体的生长过饱和溶液的形成如果溶液浓度未达到饱和固体的溶解速度大于沉积速度
沉淀法的分类
根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： 根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： 盐析法； （1）盐析法； 有机溶剂沉淀法； （2）有机溶剂沉淀法； 等电点沉淀法； （3）等电点沉淀法； 选择性沉淀法； （5）选择性沉淀法； 非离子型聚合物沉淀法。 （4）非离子型聚合物沉淀法。
例如对于α 淀粉酶等热稳定性好的酶， 例如对于α-淀粉酶等热稳定性好的酶，可 以通过加热进行热处理， 以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白 受热变性沉淀而被除去。 受热变性沉淀而被除去。
选择性沉淀法－ 选择性沉淀法－选择性分离核酸
酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等 氯仿、 目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则 目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀， 存在于水溶液中。 存在于水溶液中。 在核酸提取液中加入氯仿-戊醇，振荡一段时间、 在核酸提取液中加入氯仿-戊醇，振荡一段时间、使蛋白 质在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除去， 质在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在 水溶液中。 水溶液中。 DNA、RNA混合溶液中 用异丙醇选择性地沉淀DNA 混合溶液中， DNA， 在DNA、RNA混合溶液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA，而 RNA留在溶液中 留在溶液中。 RNA留在溶液中。
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B. 饱和溶液法
用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可 防止局部过浓，但加量较多时，样品会被稀释。
C. 透析法
先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入大体积饱和硫 酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度 后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连 续性，盐析效果好，但程序繁琐，故用于要求较精确、 样品体积小的试验中使用（如结晶）。
化学因素：有强酸、强碱、尿素、重金属盐、SDS等。
蛋白质表面特性－沉淀屏障
蛋白质分子周围的水化层
水溶液中蛋白质可视为胶粒，其周围存在着稳 定的水化层， 胶粒外的这部分水客观上起排斥 作用，称为“水化层斥力”
分子间的静电排斥作用
蛋白质表面特性 ——沉淀策略及方法
策略
破坏蛋白质四周水化层 降低双电层厚度
eGFP的最佳盐析范围是45%- 60%
分级沉淀2 （根据分级沉淀1 的结果，确定浓度范围）
0～ 25%饱和度盐溶液，杂质盐析（沉淀），有效成分盐溶。 离心，得上清（含有效成分）。
上清中25%～ 60%饱和度盐溶液，有效成分盐析， 另一部分杂质盐溶。
二、制备蛋白质
蛋白质表面特性－蛋白质组成
蛋白质组成
20 种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性 氨基酸和亲水性氨基酸
蛋白质折叠趋势
疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势
结果
在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基 暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区
蛋白质表面特性－蛋白质性质
1. 盐分级沉淀
固体硫酸铵加入量
1 L 溶液中硫酸铵的百分饱和度由 S1 增大到 S2 所需要加入的固体硫酸铵质量g 为
g
533S2 S1
100 0.3S2
（20℃）
g 541S2 S1 （25℃）
100 0.3S2
也可使用“表 2-1 调整硫酸铵溶液饱和度的计 算表（P22）”
增强绿色荧光蛋白eGFP的硫酸铵盐析曲线（沉淀）
2. 盐析曲线制作
1
protein relative content in supernatant )
0.8
0.6
0.4
0.2
0 0
20
40
60
80
100
％ of saturation of ammonium sulphate
硫酸铵盐析时上清中的蛋白含量 ● eGFP含量 ； ■ 总蛋白含量。
溶解度大——可配制成具有较高离子强度的 无机盐溶液
溶解度受温度的影响较小 盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀的沉降或
离心分离。
1. 盐分级沉淀
盐的选择 通常采用中性盐，最常用硫酸铵，原因： 水中溶解度大，分级效果好，不易引起蛋 白质变性，廉价易得，分段效果好。
硫酸铵：
20℃下，饱和浓度为4.1 mol / L（相当于533 g/L） 0℃下，饱和浓度为3.9 mol / L（相当于505 g/L）
纯化方法
分离纯化：除去各种杂质，获得较高纯 度物质的过程。
蛋白质和酶分离提纯方法：沉淀分离、 层析分离、电泳分离、超离心分离等。
第二章 沉淀法
盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性沉淀
第一节 基本原理与沉淀类型
一、基本原理
沉淀分离：通过改变某些条件或加入某种物 质，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而 从溶液中沉淀析出的技术。
盐析沉淀-盐析的定义
定义
蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、 发生沉淀的现象称为盐析。
低离子强度下的盐溶
向蛋白质的纯水溶液中加入电介质后，蛋白质将吸附盐离子， 而形成扩散双电层（产生分子间相互排斥作用）导致蛋白质 的溶解度增大，发生盐溶。
高离子强度下的盐析
由于盐的水化作用，其将争夺蛋白质水化层中的水分子，使 蛋白质表面疏水区脱水而暴露，增大它们之间的疏水性作用。
1. 盐分级沉淀
液体（饱和度100%）硫酸铵加入量
硫酸铵的百分饱和度由 S1 增大到 S2 所需要加 入的硫酸铵溶液体积V 为
V V 0 S 2 S1 （20℃） S3 S2
V0，原来溶剂的体积（ml）； S3，100（一般用100%饱和度的液体硫酸铵）
2. 盐析曲线制作
分级沉淀
将每步离心获得的沉淀重新溶解，测定其中 总蛋白和目标蛋白的浓度。
以硫酸铵的饱和度为横坐标、沉淀中总蛋 白和（或）目标蛋白浓度为纵坐标，得到 蛋白质盐析曲线。
分级沉淀1 （每步测定沉淀中总蛋白及有效成分含量）
relative content of eGFP in precipitate '
2. 盐析曲线制作 0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0 0 10 20 30 35 40 50 60 65 70 80 saturation of ammonium sulphate, %
盐析的机理
①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶 解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度， 破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下 降；
②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；
③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水 分子的极化，使水活度降低。
1. 盐分级沉淀 1）盐的选择
沉淀方法
改变溶液 pH 值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机术
盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性沉淀
（一）盐析法
盐析沉淀-学习要点 识记：盐析和盐溶概念 理解：盐析沉淀的原理，影响盐析的各种因素 应用：掌握盐析操作过程
1. 盐分级沉淀
2）硫酸铵盐析（加硫酸铵至一定饱和度）
分级沉淀1 （每步测定有效成分含量和总蛋白含量）
1. 盐分级沉淀
硫酸铵的加入有以下几种方法： A. 固体法
用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上 常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并 充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；
蛋白质的胶体性质
蛋白质的分子量约6～1000 kDa，分子直径约为1～30 nm。 在此粒径范围内，蛋白质可视为胶体，并表现出胶体溶液 的部分性质
蛋白质的两性电离和等电点
蛋白质两端及侧链中有一些解离基 ，解离程度受pH影响。
蛋白质的变性
物理因素：加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、 超声波的作用等；
用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可 防止局部过浓，但加量较多时，样品会被稀释。
C. 透析法
先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入大体积饱和硫 酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度 后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连 续性，盐析效果好，但程序繁琐，故用于要求较精确、 样品体积小的试验中使用（如结晶）。
化学因素：有强酸、强碱、尿素、重金属盐、SDS等。
蛋白质表面特性－沉淀屏障
蛋白质分子周围的水化层
水溶液中蛋白质可视为胶粒，其周围存在着稳 定的水化层， 胶粒外的这部分水客观上起排斥 作用，称为“水化层斥力”
分子间的静电排斥作用
蛋白质表面特性 ——沉淀策略及方法
策略
破坏蛋白质四周水化层 降低双电层厚度
eGFP的最佳盐析范围是45%- 60%
分级沉淀2 （根据分级沉淀1 的结果，确定浓度范围）
0～ 25%饱和度盐溶液，杂质盐析（沉淀），有效成分盐溶。 离心，得上清（含有效成分）。
上清中25%～ 60%饱和度盐溶液，有效成分盐析， 另一部分杂质盐溶。
二、制备蛋白质
蛋白质表面特性－蛋白质组成
蛋白质组成
20 种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性 氨基酸和亲水性氨基酸
蛋白质折叠趋势
疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势
结果
在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基 暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区
蛋白质表面特性－蛋白质性质
1. 盐分级沉淀
固体硫酸铵加入量
1 L 溶液中硫酸铵的百分饱和度由 S1 增大到 S2 所需要加入的固体硫酸铵质量g 为
g
533S2 S1
100 0.3S2
（20℃）
g 541S2 S1 （25℃）
100 0.3S2
也可使用“表 2-1 调整硫酸铵溶液饱和度的计 算表（P22）”
增强绿色荧光蛋白eGFP的硫酸铵盐析曲线（沉淀）
2. 盐析曲线制作
1
protein relative content in supernatant )
0.8
0.6
0.4
0.2
0 0
20
40
60
80
100
％ of saturation of ammonium sulphate
硫酸铵盐析时上清中的蛋白含量 ● eGFP含量 ； ■ 总蛋白含量。
溶解度大——可配制成具有较高离子强度的 无机盐溶液
溶解度受温度的影响较小 盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀的沉降或
离心分离。
1. 盐分级沉淀
盐的选择 通常采用中性盐，最常用硫酸铵，原因： 水中溶解度大，分级效果好，不易引起蛋 白质变性，廉价易得，分段效果好。
硫酸铵：
20℃下，饱和浓度为4.1 mol / L（相当于533 g/L） 0℃下，饱和浓度为3.9 mol / L（相当于505 g/L）
纯化方法
分离纯化：除去各种杂质，获得较高纯 度物质的过程。
蛋白质和酶分离提纯方法：沉淀分离、 层析分离、电泳分离、超离心分离等。
第二章 沉淀法
盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性沉淀
第一节 基本原理与沉淀类型
一、基本原理
沉淀分离：通过改变某些条件或加入某种物 质，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而 从溶液中沉淀析出的技术。
盐析沉淀-盐析的定义
定义
蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、 发生沉淀的现象称为盐析。
低离子强度下的盐溶
向蛋白质的纯水溶液中加入电介质后，蛋白质将吸附盐离子， 而形成扩散双电层（产生分子间相互排斥作用）导致蛋白质 的溶解度增大，发生盐溶。
高离子强度下的盐析
由于盐的水化作用，其将争夺蛋白质水化层中的水分子，使 蛋白质表面疏水区脱水而暴露，增大它们之间的疏水性作用。
1. 盐分级沉淀
液体（饱和度100%）硫酸铵加入量
硫酸铵的百分饱和度由 S1 增大到 S2 所需要加 入的硫酸铵溶液体积V 为
V V 0 S 2 S1 （20℃） S3 S2
V0，原来溶剂的体积（ml）； S3，100（一般用100%饱和度的液体硫酸铵）
2. 盐析曲线制作
分级沉淀
将每步离心获得的沉淀重新溶解，测定其中 总蛋白和目标蛋白的浓度。
以硫酸铵的饱和度为横坐标、沉淀中总蛋 白和（或）目标蛋白浓度为纵坐标，得到 蛋白质盐析曲线。
分级沉淀1 （每步测定沉淀中总蛋白及有效成分含量）
relative content of eGFP in precipitate '
2. 盐析曲线制作 0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0 0 10 20 30 35 40 50 60 65 70 80 saturation of ammonium sulphate, %
盐析的机理
①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶 解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度， 破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下 降；
②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；
③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水 分子的极化，使水活度降低。
1. 盐分级沉淀 1）盐的选择
沉淀方法
改变溶液 pH 值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机术
盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性沉淀
（一）盐析法
盐析沉淀-学习要点 识记：盐析和盐溶概念 理解：盐析沉淀的原理，影响盐析的各种因素 应用：掌握盐析操作过程
1. 盐分级沉淀
2）硫酸铵盐析（加硫酸铵至一定饱和度）
分级沉淀1 （每步测定有效成分含量和总蛋白含量）
1. 盐分级沉淀
硫酸铵的加入有以下几种方法： A. 固体法
用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上 常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并 充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；
蛋白质的胶体性质
蛋白质的分子量约6～1000 kDa，分子直径约为1～30 nm。 在此粒径范围内，蛋白质可视为胶体，并表现出胶体溶液 的部分性质
蛋白质的两性电离和等电点
蛋白质两端及侧链中有一些解离基 ，解离程度受pH影响。
蛋白质的变性
物理因素：加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、 超声波的作用等；