食品安全与检测课件 1ELISA知识简介

4.结果测定
肉眼观察：白色背景上观察四孔呈现的颜色反应，与已知阳 性和阴性孔比较。
酶联仪比色：酶Hale Waihona Puke Baidu仪用492nm测OD值。正常人血清OD﹤0.39， 结核患者≥0.4。正常人存在着结核抗体，一般为0.2－0.39。 儿童卡介苗接种和隐性结核菌感染时可﹥0.4，但患结核病结 核抗体OD值≥0.6，为轻度升高。
1.原理
ELISA法间接法测定抗体
2.材料（以测结核抗体为例）
试剂：结核抗体诊断试剂盒 器材：酶联仪，微量加样器，吸头等
3.方法
包被抗原：在聚苯乙烯微量反应板孔中加抗原100μl，4℃ 12－18小时。
用1％BSA或正常兔血清4℃、12－18小时阻断，4℃冰箱备用。
洗涤：用前应进行漂洗去除杂蛋白，用洗涤液洗3次，每次3 分钟。
将已知抗原或抗体吸附在固相载体微孔聚苯乙烯塑料板上， 通过抗原抗体特异性结合吸附待测样品中的抗体或抗原后，加 酶标抗体（酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原免疫 反应的特异性，又不影响酶本身的活性）和底物后，在相应酶 底物的作用下生成有色物质，其颜色深浅与标记物中相应的抗 体或抗原的含量呈正比，由此可测定抗原或抗体的含量。
1.1.1 可逆性
抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态 平衡，其反应式为：
Ag+Ab→Ag·Ab
抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示： K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关。 高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上 非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗 体均能保持原有的结构和活性。
加待测样本：将血清稀释成1：50，每份标本加复孔，每孔 100μl，37℃保温30分钟。设已知的阳性和阴性血清对照。
洗涤3次后，加兔抗IgG酶结合物，37℃保温30分钟，以相同 的方法洗涤3次。
加新鲜配制的邻苯二胺底物溶液和双氧水溶液各100μl。静止 20分钟，再加入3mol/L硫酸每孔50μl终止反应。
于需要定量检测时。
2.材料（以测HBsAg为例）
试剂：HBsAg诊断试剂盒 器材：酶联仪，微量加样器，吸头等
3.方法
加样：每组7微孔，待检4孔，空白对照1孔，阴、阳性对照各 1孔。分别加阴、阳性对照1滴和50ul待测样本于相应孔内，置 37℃水浴箱温育30分钟。
加酶：除空白对照孔外，每孔加1滴酶标溶液，混匀后封板， 置37℃水浴箱温育30分钟。
2.2.4 竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化 抗原时，可用此法检测特异性抗体。
2.2.5 竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点， 因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式 。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相 抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标 抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA 测定多用此法。
2.2.3 间接法测抗体
传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用 同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
ELISA夹心法测定抗原 ELISA间接法测定抗体
原理及意义
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay ， ELISA)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与 酶对底物的高效催化作用结合起来的一种敏感性很高的新型免 疫检测技术。
常用的ELISA法有双抗体夹心法测定抗原和间接法测定抗体。
ELISA法双抗体夹心法测定抗原
1.原理
二
一 步
步 法
法
常用试剂盒分一步法和二步法，二者原理完全相同。 一步法 将图中的第2步和第3步同时进行，允许混合加入，其形成的免 疫复合物，基本不影响目测的结果，适用于目测结果。
二步法 如图中第2步和第3步由于分步进行，其结果较准确，主要用
1.4 免疫测定在临床检验中的应用
由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备 特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可 检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。
2 ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方 法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent ）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）； （3）酶反应的底物。
洗涤：用洗涤液（按说明配制）注满各孔，静置20秒，甩去 洗涤液，重复4次，最后一次在吸水纸上拍干。
显色：每孔加底物液A 、B 各1滴（50ul），轻拍混匀，置 37℃水浴15分钟，肉眼观察。
终止：每孔加终止液1滴（50ul），轻拍混匀。
4.结果测定
用酶标仪（450nm）测定各孔吸光度OD值（先用空白孔校零）， P/N值≥2.1者判为HBsAg阳性，﹤2.1者判为阴性。
ELISA 知识简介
酶免疫测定类型
酶免疫组化
酶免疫技术
均相酶免疫测定
酶免疫测定
非均相酶免疫测定
固相酶免疫测定
液相酶免疫测定
这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫 吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay） ，简称ELISA。
1.1 抗原抗体反应
可设计出各种不同类型的检测方法。
2.2.1 双抗体夹心法测抗原
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、 HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就 可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
2.2.2 双抗原夹心法测抗体
用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标 本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间 接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关 键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合 适的标记方法。
1.1.2 特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之 间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。
测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
1.1.3 最适比例
1.1.4 敏感性
化学比色法的敏感度为mg/ml水平 酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿 标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平 例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。