重组病毒载体研究进展

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重组1和2型腺相关病毒载体在小鼠心脏转导研究

ａｌｍｉｅ．ｈｘｒｓｉｎｏＶ１ＥＧＦｗａｅｎｉａｄａｏｙｅｒｍｐｃｒｉｍｏｅｄａｄｕｌｃＴｅｅｐｅｓｏｆＬ．Ｐｓｓｅｎｃｒｉｃｍｙｃｔｓｆｏｅｉａｄｕｔｎｏｒｉｍ．Ｔｅｃｈ
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中华老年脑血管病杂志２０年４第９第４０７月卷期（ｉＪｅａＨａＢＶｓｌｉＡ０７Ｖｌ，ｏ４１ｎｆｌｅｒ凼ｅｅＤｓ２０，ｏ９Ｎ．ａＧｉｒｔｓ，
・２５・５
ＡｓａｔＯｊｃｉＴｅｒｉｅｅａｙｏａｓｕｔｎｏｃｍｉｎａｅｏａｏｉｅｉｓｅｔｓｂｔｃ：ｂｅｔｅｏｄｔｍｎｔ￣ｃｆｔｎｄｃｏｆｅｏｂａｔｄｎ－ｓａｄｖｕｃｒｒｖｅｅｈｃｒｉｒｎｓｃｔｒｖｏ
Ｍａｆ，Ｌｉ — ｎ，Ｎａ—ｈｎｔｌＩ－ｉＩａｙｇＷＡＧＪｏｃｅ，ｅａＹｅＸｏｉｉ
（ｅａｍ￣ｏｅａｗＣｒｉｏｙｈｅＩｅｅａＨｓｉ，ｎｊｇ１０５，Ｃ／）ＯｐｎｅｆＧｒｔａｄｌ，ＣｉｓＰＡＧｎｒｏｔｉｒｏｇｎｅｌｐａｌａｉ０８３ｈａｎｎ
摘要：探讨重组１２目的和型腺相关病毒（ＡｌｒＡ２载体向小鼠心脏转导效果。方法１只昆明小鼠应ｒＶ和Ａｖ）Ａ４
用经腹心包腔内注射术，分别将携带增强绿色荧光蛋白（ＧＰ、ＥＦ）荧光素酶（ｃ报告基因的ｒＡ１ｒＡ１ＧＰ组叫）ＡＶ（ＡＶ一ＦＥ

MGMT基因重组腺病毒载体的构建

ｓｐｒａａｇｅｉｉｏｏｉｅｎｎｐｒｉｌｓａｄｔａｓｅｔｎｕｅｐｒｍａｎｔｃｒｎｘｄａｏａｃｅｎｒｎｆｃｉｔｏ
［］ＷａｇＢＪｃｎＭ，ｉ，ｔ１Ｍａｉｇｆｍｒｎｃｔ２ｎ，ａｏｉＬＪｅａ．Ｒｉｇｂｏｉｓｍｍｎｏｅｙｅｃｌｂｌｙｓｐｒｒａｎｔｏｘｅ［］ＺｏｇｕｉｅｓｌｅｄｂｕｅａｍｇｅｃｉｎｏｉＪ．ｈｎｈａｌａｅｐａｉｒｄＹ
［］ＪＤｇＴｒｅ，２０，１（）９ — ０．Ｊ．ｒａｇｔ０７５４：２５３１ａ
ＭｃｉＢａｎＳＣ，ＹｉｕＨＨ，ＤｏｓｎＪｂｏ．Ｍａｎｔｎｎｐｒｉｌｓｆｒｇｅｉａｏａｔｃｅｏｃ
ｇｎｎｒｇｄｌｅｙ［］Ｉｔａｏｄｃｅ０８（）ｅｅａｄｄｕｅｖｒＪ．ｎＮｎｍｅｉｉ，２０，３２：ｉＪｎ
１９－１Ｏ．６８ＴｍｅｏｙＦ，ＴｒｗｎＢＧ，ＬｎＶＳ，ｅ１Ｍｅｏｏｏｓｓｌｃｅｙｉｔａ．ｓｐｒｕｉａｉ
ＸｅＺｈ，２０，８（３：１４ — ６８ｕａＺｉ０７７２）６６１４．
ａｅｔｒｃｌｌｍｇｎＪ．Ｒｄｏｏｙ，２０ｇｎｅｕａＭＲｉａｉｇ［］ａｉｇｏｆｌｒｌ０３，２９３：２（）
８ —４３８８６．
４参考文献

病毒载体疫苗研究进展

病毒载体疫苗研究进展
王步森;徐婧含;高智强;侯利华
【期刊名称】《合成生物学》
【年(卷),期】2024(5)2
【摘要】近十年来,中东呼吸综合征、埃博拉出血热、寨卡病毒感染、新型冠状病毒肺炎等重大传染性疾病疫情相继出现,对疫苗的快速研发提出重大挑战。

其中病毒载体疫苗是新型疫苗研发的重要形式,它可以通过雾化吸入或口服等方式进行无创免疫,在没有佐剂的情况下发挥免疫作用,同时诱导体液、细胞和黏膜免疫反应,具有良好的免疫原性和安全性。

随着对病毒基因组和结构蛋白等元件认识的不断深入,利用合成生物学研究思路系统设计、改造病毒载体,从而赋予重组病毒载体疫苗高滴度生产、高安全性和高免疫原性等生物学特征,对疫苗研发具有重要指导意义。

本文综述了复制型、非复制型等病毒载体疫苗研发策略,以及具有临床应用价值的疫苗病毒载体,如腺病毒载体、痘病毒载体、水疱性口炎病毒载体等,希望对利用合成生物学进行新型病毒载体疫苗的研发提供一定的参考。

未来,病毒载体疫苗必将向着更高的安全性、更强的保护性、更好的依从性、更低的生产成本等方向迭代发展。

【总页数】13页(P281-293)
【作者】王步森;徐婧含;高智强;侯利华
【作者单位】军事科学院军事医学研究院前沿生物技术实验室
【正文语种】中文
【中图分类】R373
【相关文献】
1.新城疫病毒载体疫苗研究进展
2.腺病毒载体疫苗的研究进展
3.非洲猪瘟病毒载体疫苗研究进展
4.基于甲病毒载体兽用疫苗的研究进展
5.mRNA疫苗非病毒载体递送系统研究进展
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应用禽痘病毒表达载体研制重组疫苗的研究进展

禽痘病毒（ｏｐｘＶｉｓＰ为痘病毒科、Ｆｗｌｏｒ，ＦＶ）ｕ禽痘病毒属的成员，中鸡痘病毒是禽痘病毒属的代表其
种。熟的病毒粒子为砖型，小为２０ｎ ×３４ｎ成大５ｍ５ｍ，病毒的基因组是双股线性ＤＮＡ，３０ｋ分子量约约０ｂ．为２００￣４００ｋ．０ ×１０Ｘ１ＤａＧ＋Ｃ含量达３，且其５
向末端重复序列（ＴＲ）在常规的病毒传代中．同来Ｉ，不
源的毒株可发生末端序列的重组；ＴＲ还存在着重排Ｉ
和删除的可能性ＦＶ与痘苗病毒一样末端都存在ｌＰ２个碱基对（ＡＡＡＡＴＣｒＴＴＴＡ）｜ｒ的保守序列
类造成的潜在威胁。除此之外，痘病毒的宿主范围较禽
窄．仅感染禽类，哺乳动物体内产生一过性感染．它在
或称为流产性感染．它能有效感染一些哺乳动物的即细胞和表达早期基因。也能产生一些晚期基因的表达
２河南农业大学牧医工程学院，．河南郑州４００；．５０２３中国农、部畜牧兽医局，京１０２，ｌ北００６中圈分类号：８２６９１￥５．５．文献标识码：Ａ文章编号０７５３（０２００４０１０ — ０８２０３１０３４
如基因组结构庞大，有多个复制非必需区，在其感含可染的细胞中忠实地进行修饰，源基因的表达产物可外以诱导机体产生持续时问较长的体液与细胞免疫反

基于反向遗传学操作技术新城疫病毒载体的研究进展

基于反向遗传学操作技术新城疫病毒载体的研究进展林初文;谢金文;王善辉;苗立中;沈志强【摘要】新城疫病毒是严重危害养禽业的重要疫病——新城疫的病原微生物.随着反向遗传学操作技术的快速发展,重组新城疫病毒载体已成为新城疫研究的重点,也是当今病毒载体系统研究的热点之一.笔者在简要综述了新城疫病毒的基因组结构和反向遗传载体的构建等的基础上,重点阐述了新城疫病毒载体在外源基因表达方面的研究概况.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(040)035【总页数】4页(P17146-17149)【关键词】反向遗传学;新城疫病毒;载体【作者】林初文;谢金文;王善辉;苗立中;沈志强【作者单位】山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600【正文语种】中文【中图分类】G813.1新城疫(Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV）引起的多种禽类易感的一种急性、高度接触性、毁灭性传染病，也是目前严重危害我国养禽业的重要疫病之一。

反向遗传学(Reverse genetics）是相对于经典遗传学而言的。

经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律，而反向遗传学与经典遗传学的研究思路正好相反，是直接从生物遗传物质入手，通过对遗传物质进行加工和修饰来研究基因突变后产生的生物体的特性(表型和性状等），从而确定生物体基因组的结构与功能以及这些突变可能对生物体特性的影响。

与之相关的各种研究技术统称为反向遗传学技术(Reverse genetics manipulation technique）［1－3］，主要包括 RNA 干扰 (RNA interference，RNAi）技术、基因沉默技术、基因体外转录技术等，是DNA重组技术应用范围的扩展与延伸。

MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及表达的开题报告

CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及表达的开
题报告
一、研究背景和意义：
癌症是世界公认的重大疾病之一，在其中恶性黑色素瘤的死亡率也非常高。

通过疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症的方法已经成为重要的研究方向，包括恶性黑色素瘤。

而MAGE-A3和CRT是在恶性黑色素瘤中表达的抗原，且它们的表达在癌细胞和正常细胞中有明显的差异。

因而它们被认为是恶性黑色素瘤的潜在免疫治疗靶点。

二、研究内容和方案
本研究通过将MAGE-A3和CRT基因插入到腺病毒载体中，构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体，并在细胞水平表达融合蛋白。

具体步骤如下：
1. 通过RT-PCR方法从恶性黑色素瘤组织中提取MAGE-A3和CRT 基因。

2. 将MAGE-A3和CRT基因克隆到腺病毒载体中，形成CRT/MAGE-A3重组载体。

3. 利用PCR进行扩增，通过酶切和测序进行CRT/MAGE-A3重组载体的鉴定。

4. 将CRT/MAGE-A3重组载体转染到恶性黑色素瘤细胞株中，通过Western Blotting方法检测融合蛋白CRT/MAGE-A3的表达和纯度。

三、研究预期结果
1. 成功构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体。

2. 观察到CRT/MAGE-A3的表达并在细胞中得到验证。

3. 为下一步开展体内实验打下坚实基础，为疫苗调节免疫系统来预防或治疗癌症奠定理论基础。

四、研究意义
本研究有望为恶性黑色素瘤的免疫治疗提供新的方法和思路，也有望开展潜在的抗癌疫苗研究。

同时还有望在癌症免疫治疗的新技术方面提供一定的探索，为癌症的预防和治疗提供新的思路和方法。

小鼠miR-122重组慢病毒载体的构建和鉴定

Ｔｅｐｅｍｉ１２ｇｎｓａｌｅｒｍｕｅｇｎｍｉＮＡｙＰｈｒ－Ｒ一ｅｅｗａｍｐｉｄｆｏｍｏｓｅｏｃ２ｉｆＤｂＣＲ，ｗｉｈｗｓｃｏｅｏｔｅｈｃａｌｎｄｔｈｒｔｖｒｌｖｃｏｓｏＣＤＨ— ＭＶ－ｅｒｉｅｔｒｆｐｏａＣＭＣＳＥ一ｏＧＰａｄｓｑｅｃｄｆｒｖｒｌｐｃａｉｇｔｅＮＩＴ — Ｆ１ｃｐＦｎｅｕｎｅ．Ａｔｉａｋｇｎ，ｈＨ３３ｅａｃｌｅｅｔａｓｅｔｄｉｅｏｉａｔｌｎｉｉｖｃｏ．Ｔｅｔｅｆｖｒｓｗａｅｅｔｄｙｇｅｎｅｌｗｒｒｎｆｅｅｗｔｒｃｍｂｎｎｅｔｒｓｈｖａｅｔｒｌｈｉｒｏｉｓｄｔｃｅｂｒｅｔｕ
ｃｐＦｏＧＰ感染的肝前体细胞中ｍｉ．２Ｒ１２表达显著增强。结论【关键词】ＭｉｒＲＡ一２；体构建；ｃＮ１２载ｏ慢病毒
中图分类号：９７１Ｑ８．文献标识码：Ａ
成功构建了小鼠ｍｉ１２重组慢病Ｒ．２
毒．并在肝前体细胞中高效表达出ｍＲ１２为进行ｍＲ１２的功能和机理奠定了良好的基础。ｉ一２，ｉ一２
邱荣林邓小耿
【要】目的摘
机制奠定基础。方法
谢平李治熹唐晶
构建携带ｍＲ１２ｉ．的重组慢病毒表达载体，２为研究ｍＲ１２的功能和作用ｉ．２从小鼠基因组ＤＡ采用ＰＲ法扩增出ｐｅｍＲ１２基因，ＮＣｒ— ｉ一２测序后克隆至

腺病毒载体构建原理与方法的研究进展

作者单位:100052北京,中国预防医学科学院病毒学研究所病毒形态研究室#综述#腺病毒载体构建原理与方法的研究进展何金生王健伟洪涛由于腺病毒(Adenovirus,Ad)载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性,使其在基因疫苗及基因治疗的研究中受到人们的青睐,成为当今使用最多的病毒载体之一。

为了取得更满意的效果,人们在腺病毒载体构建与改进方面,做了大量工作。

本文谨就近年来腺病毒载体构建原理与方法的研究进展扼要综述如下。

1腺病毒载体的构建原理腺病毒的基因组为线形双链DNA,长度约为36kb,被包装在一个二十面体的蛋白质外壳内,可分为编码区和非编码区。

编码区又可分为早期转录区和晚期转录区两种,前者有E1、E2、E3、E4四个区,编码病毒的调节蛋白,后者有L1、L2、L3、L4、L5五个区,编码病毒的结构蛋白。

非编码区含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。

除E3区外,其余的编码区及顺式作用元件均为病毒复制所必需。

第1代腺病毒载体是由去除腺病毒基因组的E1和P或E3两个区而获得,其复制必须在由5型腺病毒转化的可组成性表达E1蛋白的293细胞中完成。

其主要优点为:在体外有很高的繁殖滴度(1011~1012PFU P ml);易感的宿主细胞范围广,既能感染增殖细胞,又能感染非增殖细胞;病毒基因组存在于细胞染色体外,避免了因整合引起的细胞突变。

但由于病毒载体与表达E1蛋白的293细胞之间存在同源序列。

在293细胞中繁殖时,通过重组,可重新获得E1区,出现复制型腺病毒(Replication-competent Ads, RCAs),这使得第1代腺病毒载体的应用受到限制112。

此外,由于发现在多种转化及原代的细胞内存在具有Ela样活性(Ela-like activity)的物质,因而E1区缺失的腺病毒载体在这些细胞内,仍能进行Ela非依赖性的腺病毒DNA复制,并从头合成病毒的早期和晚期蛋白,激发宿主针对腺病毒的细胞和体液免疫,使载体在体内的持续时间以及再次应用均受到极大影响122。

猪伪狂犬病病毒载体重组疫苗研究进展

ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００８－０５８９．２０１４．０２．１８
猪伪狂犬病病毒载体重组疫苗研究进展
王林青１，２，郑兰兰一，李坤，陈红英１，３，李文增ｚ，李坤陶ｚ，崔保安
感染细胞分泌物中，其他糖蛋白均为病毒囊膜的成分［２］。
目前，以ＰＲＶ作为活病毒载体构建的基因缺失疫苗株通
常为缺失、ｇＩ、ｇＧ、ｇｃ及ＴＫ等非必需基因，也有缺
毒力因子。ＴＫ基因的缺失显著降低病毒毒力，但不影响
ｇＧ／Ｍ１接种ＰＫ．１５细胞，在感染早期（６ｈ）则可以观察到荧光，随着病毒的增殖（２４ｈ～３６ｈ），荧光逐渐增强，直至完全病变，荧光淬灭。绿色荧光也可以作为活细胞示踪实时监测病毒感染的动态分析。ｅＧＦＰ作为报告基因的通用转移载体ＴＫ－／ｇＧ－／ｌａｃＺ￣、以ＧＦＰ作为筛选标记的ＰＫ和ｇＧ基因双缺失的疫苗株和稳定表达ＩａｃＺ基因的ＰＲＶ
文献标识码：Ｂ
文章编号：１００８．０５８９（２０１４）０２．０１６０．０５
猪伪狂犬病病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ，ＰＲＹ）又名猪疱疹病毒Ｉ型（ＳｕｉｄｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｔｙｐｅＩ），属于疱疹病毒科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）甲亚科（Ａｌｐｈａｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ）水痘病毒属（ＶａｄｃｅＨｏｖｉｍｓ），为线状双股ＤＮＡ病毒，全长约１５０ｋｂ，含有７７个读码框，平均Ｇ＋Ｃ含量高达７３．６％。ＰＲＶ由独特的长区段（ｕＬ）和短区段（ｕｓ）及位于ＵＳ两侧的末端重

重组腺病毒载体敲减ApoE--小鼠血管平滑肌细胞Orai1基因模型的构建

DOI：10.3969/j.issn.l007-5062.2021.03.015•基础研究•重组腺病毒载体敲减ApoE-/-小鼠血管平滑肌细胞Orai1基因模型的构建费舒扬葛长江［摘要］目的：为探讨Orai1基因在动脉粥样硬化进展中的作用，通过重组腺病毒载体建立ApoE"小鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)Orai1基因的敲低模型,为深入相关研究奠定基础。

方法：构建针对小鼠Orai1基因的重组腺病毒载体。

高脂饲养ApoE，小鼠至16周龄后处死。

取胸主动脉原代VSMCs改为体外培养，细胞分为三组,分别为shOrai1组、shNC组和对照组。

转染后通过实时定量聚合酶链式反应(qPCR),Western blot检测Orai1表达水平，同时对转染模型进行验证。

结果：qPCR示，重组腺病毒在ApoE"小鼠VSMCs中Orai1基因的干扰效率达57%,Western blot结果示,Ad-GFP-Orial-shRNA转染组Orai1蛋白表达水平显著降低。

结论：通过成功建立ApoE"-小鼠VSMCs中Orai1基因敲低模型，从而为阐明钙库操纵性钙通道在动脉粥样硬化进程中的作用，尤其关于斑块延展和不稳定的相关性研究奠定了基础。

［关键词］Orai1基因；动脉粥样硬化;核糖核酸干扰;血管平滑肌细胞［中图分类号］R54［文献标志码］A［文章编号］1007-5062(2021)03-281-06Establishment of Orail gene knock down model in ApoE""mouse vascular smooth mucsle cells with adenovirus interference vector FEI Shuyang,GE Changjiang Department of Cardiology,Beijing Anzhen Hospital,Capital Medical University,Beijing Institute of Heart,Lung and Blood Vessel Diseases,Beijing100029,China［Abstract］Objective:To further investigate the role of calcium release-activated calcium channelmodulator1(Orai1)in the process of Atherosclerosis,the recombinant adenovirus vector was used to establishthe ApoE--mouse vascular smooth mucsle cells(VSMCs)Orai1gene knock down model for further relatedstudies.Methods:A recombinant adenovirus vector(Ad-GFP-Orial-shRNA)targeting the Orai1gene in micewas constructed.ApoE--mouse fed with high-fat diet were sacrificed at16weeks of age.VSMCs extracted fromthe thoracic aorta were cultured in vitro.The cells were randomly divided into3groups for Ad-GFP-Orial-shRNA infection,Ad-GFP-NC-shRNA infection and control group.Orai1expression was tested by qPCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)and Western blot to validated the model.Results：qPCRshowed that the Orai1mRNA in VSMCs decreased by57%,Western blot showed that Orai1protein expressionlevel was significantly reduced.Conclusions:The ApoE--mouse VSMCs Orai1gene knock down model wassuccessfully established,building a foundation to further study the mechanism of SOCC participate in theprocess of atherosclerosis and its impact on plaques'extension and instability.［Keywords］Orai1；RNA intereference；Atherosclerosis；Vascular smooth mucsle cells钙库操纵性钙通道(stored operated calcium内流的重要离子通道，参与调节血管平滑肌细胞channel,SOCC)是非兴奋细胞所介导胞质外钙离子(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的增殖、迁移基金项目：2020年北京自然科学基金（7202039）作者单位：100029首都医科大学2018级临床心血管专业硕士研究生（费舒扬）；首都医科大学附属北京安贞医院-北京市心肺血管疾病研究所心内科（葛长江）通信作者：葛长江,教授,研究生导师，博士，研究方向：冠心病的药物和介入治疗。

重组腺相关病毒（AAV）载体构建技术原理

重组腺相关病毒（AAV）载体构建技术原理腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微⼩病毒科（parvoviridae）家族的成员之⼀，是⼀类⽆法⾃主复制、⽆被膜的⼆⼗⾯体微⼩病毒，其直径约20-26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。

研究中采⽤的重组腺相关病毒载体（recombination adeno-associated virus, rAAV）是在⾮致病的野⽣型AAV基础上改造⽽成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性⾼、宿主细胞范围⼴（对分裂细胞和⾮分裂细胞均具有感染能⼒）、扩散能⼒强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之⼀。

AAV基因组结构悬浮框：包装纯化及滴度检测--侵染细胞过程-- rAAV载体优势—rAAV⾎清型选择—应⽤案例rAAV包装纯化及滴度检测AAV包装过程中，包装质粒负责编码⽬的基因以及两个末端反向重复序列（ITR，对于病毒的复制和包装具有决定性作⽤），辅助质粒包含AAV包装所需的cap（编码病毒⾐壳蛋⽩）和rep（参与病毒的复制）基因，以及腺病毒Helper质粒。

三种质粒共同转染293T细胞后，AAV病毒开始复制和包装。

和元⽣物腺相关病毒的⽣产和质控采取了国际学术界公认的标准流程，采⽤三质粒系统在293T细胞中进⾏包装。

所获得的病毒颗粒经过超速离⼼纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进⾏滴定。

另外，我们也可以根据使⽤者要求，提供蛋⽩染⾊检测⾐壳蛋⽩的完整性以及内毒素含量等。

⼀般情况下rAAV的滴度在1012~1013VG/ml，完全可以满⾜各类整体实验的使⽤要求。

AAV包装流程图滴度检测⽅法：定量PCR检测病毒基因组中外源DNA拷贝数。

滴度检测原理：腺相关病毒的基因组为单链DNA，外源DNA拷贝数代表病毒基因组拷贝数。

重组鸭肠炎病毒载体疫苗研究进展

关键词：重组载体疫苗；鸭肠炎病毒；基因修饰；免疫；外源基因
中图分类号：S852.659.1
文献标志码：A
文章编号：0366-6964（2017）11-2015-08
ProgressofRecombinantDuckEnteritisVirus-vectoredVaccines
MA Yun-chao1，2，3，CHENG An-chun1，2，3* ，WANG Ming-shu1，2，3* ，WU Ying1，2，3 （1.AvianDiseaseResearchCenter，CollegeofVeterinary Medicine， SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China； 2.InstituteofPreventiveVeterinary Medicine，SichuanAgricultural University，Chengdu611130，China；
苗灭： [3-4] 活疫苗安全性高，但存在免疫保护期不够
长、制备成本较高等不足；减毒活疫苗免疫效力及免
疫保护期等常常优于灭活疫苗，但对于变异能力较
组进行遗传修饰的技术手段已十分成熟，目前已通过这些技术成功构建了多株重组鸭肠炎病毒活载体疫苗。研究
表明构建的重组鸭肠炎病毒活载体疫苗可成功抵抗鸭肠炎病毒和其他相应病原的攻击，具有作为重组病毒疫苗载
体的潜力，并在未来的禽类新型疫苗研制中发挥重要作用。本文对以鸭肠炎病毒作为载体的重组病毒活载体疫苗
的研究进展进行综述，以期为鸭肠炎病毒载体疫苗的研发提供参考。
通信作者程安春汪铭书 *
：
，E-mail：chenganchun@；
，E-mail：mshwang@

重组腺病毒生产技术研究进展

2004 年 10月The Chinese Journal of Process Engineering Oct. 2004重组腺病毒生产技术研究进展祁丽，顾铭，丛威(中国科学院过程工程所生化工程国家重点实验室，北京 100080)摘要：目前基因治疗，尤其是对癌症的基因治疗越来越多地得到人们的关注. 随着基因工程技术的发展，对癌症在基因水平上的认识不断深化，发现了很多对治疗癌症有帮助的基因，但临床面临的最大问题就是如何建立一个安全、高效、实用、可重复的基因转移系统，将这些治疗基因有效地导入靶细胞. 人们构建了各种载体，重组腺病毒就是基因治疗的重要载体之一. 能否生产出大量高质量的腺病毒载体是制约体外实验和临床实验的关键因素. 本文从感染机制、生产和纯化计数等几个方面讨论生产重组腺病毒载体的进展.关键词：基因治疗；重组腺病毒载体中图分类号：Q952 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2004)05−0475−061 前言基因治疗是近年来兴起的一种针对单基因和多基因遗传病、心血管疾病、恶性肿瘤和一些传染病的新的治疗模式，目的是将外源治疗基因导入靶细胞，在体内产生疗效. 基因导入系统是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统. 到目前为止，病毒载体在基因治疗中仍然是最有效的基因导入系统[1]. 腺病毒就是已经用于基因治疗的载体之一，与其它病毒载体相比，腺病毒载体一个主要优势是在包装细胞中能获得较高的病毒滴度，能感染分裂期和非分裂期的细胞，目前应用最多的是Ad5[2]. 用外源DNA置换出一定长度的病毒基因片断及获得重组的腺病毒，根据腺病毒载体中的病毒基因置换程度，可将其分为第一代、第二代和第三代. 第一代腺病毒载体去除了基因序列中的E1和E3区，包装外源基因的能力较小，在8.5 kb以内，主要用于单基因疾病的治疗[3]，缺点是导入基因的表达时间短和引起宿主的免疫反应，导致直接的细胞致病变作用(Cytopathic Effects，CPE)，另外，在293细胞内同源重组作用导致野生腺病毒(Replicative Competent Adenovirus，RCA)的产生[4]. 为了避免上述缺点，第二代腺病毒载体进一步去除了E2a, E2b或E4，载体的容量和安全性比第一代有所改进，但是其介导的外源基因的转染和表达时间并没有明显延长，而且产生重组病毒滴度低，另外保留的病毒基因仍有低水平的表达并引起细胞免疫反应[5,6].第三代腺病毒缺失全部或大部分腺病毒基因，或者包装腺病毒微染色体系统，这种载体缺失了病毒蛋白，所以很大程度上降低了细胞的免疫源性，并且外源基因的表达时间明显延长，但对包装细胞的要求很高，分离辅助病毒困难. 至今在临床中应用的腺病毒载体主要是第一代腺病毒载体.重组腺病毒的生产过程主要包括包装细胞的培养、病毒感染、病毒的分离纯化和病毒计数及滴度测定等几个主要步骤. 以下从腺病毒的感染机制、生产和纯化计数几个方面论述重组腺病毒载体的生产技术.收稿日期：2003−09−28，修回日期：2003−11−05基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(编号: 2001AA217121)作者简介：祁丽(1979−)，女，河南省原阳县人，硕士研究生，生物工程专业；丛威，通讯联系人，E-mail: weicong@.2 腺病毒感染机制野生腺病毒的基因组双链DNA长度为36 kb[1]. 腺病毒感染细胞主要有以下几个步骤：(1) 病毒的扩散与在细胞表面吸附. 这一步中细胞密度、直径、培养基粘度和组成是比较关键的参数；(2) 病毒颗粒与细胞膜特异受体结合后经内吞作用进入细胞，随即脱衣壳，病毒DNA进入细胞核中，这一步非常快，大约在10 min之内[7]；(3) 基因转录与病毒DNA复制，这一步又可以分为几部分，0∼2 h，E1区的转录，E1区编码的蛋白主要作用是激活其他病毒基因的转录，对有关细胞基因的转录也有调控作用，2∼6 h，早期转录区基因E1b, E2a, E2b, E3, E4的转录，这些基因的功能是控制宿主细胞的代谢和病毒DNA复制，有报道[8]证实感染6∼8 h后宿主细胞的DNA复制完全停止，用含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体感染细胞后6 h即可在线检测到报道基因的表达，20 h后达到最大表达量[9,10]，说明病毒基因的复制与翻译在20 h时就已经完成.3 宿主细胞感染腺病毒后的代谢变化细胞感染腺病毒后，细胞干重、蛋白和DNA含量、细胞大小都有不同程度的增加，如293细胞在不含血清的培养基中，细胞感染病毒后直径从15 µm增至17 µm[10]. 在感染24∼48 h后，细胞对葡萄糖的消耗以及氨和乳酸的生成量均增加了30%∼100%[11,12], O2的消耗和ATP的生成也有类似的趋势，这可能是因为除了细胞正常生长外，感染的过程需要更多的能量[13].4 重组腺病毒的生产方法生产重组腺病毒通常所使用的细胞系有贴壁依赖性细胞和悬浮培养细胞，目前使用最广的是293细胞(人胚胎肾细胞)，使用这一细胞的优点是可以获得很高的病毒滴度，缺点是由于同源重组能产生野生型腺病毒. 一些实验室建立了293悬浮培养细胞系，还有在293细胞的基础上建立了911细胞[14]. 另一个较常用的是PER.C6®(人胚胎视网膜)细胞 [15],这个细胞株最大程度地减少了野生型腺病毒的产生几率，但是该细胞已经申请了专利，使用该细胞株必须获得授权.另外已经构建的A549细胞(肺癌细胞系)可以包装E1区缺陷的腺病毒，同时降低了野生腺病毒的产生几率[16]. 以下从使用的细胞系分别说明重组腺病毒的生产方法.4.1 贴壁依赖型细胞通常贴壁依赖型细胞培养方法是用方瓶和转瓶，也可以在搅拌条件下使用微载体进行培养. 贴壁依赖型细胞一般用于细胞外分泌蛋白的工艺，当用于腺病毒载体的培养时，只能收集细胞后再进行破碎使腺病毒释放到介质中，但是这种方法由于贴附表面的限制放大比较困难，而且培养基中的血清增加了对下游分离纯化工艺的要求.通常在贴壁培养条件下293细胞的接种密度大约在(1∼1.5)×104个/cm2，当细胞增殖到105个/cm2时接种病毒，贴壁培养的细胞比悬浮培养的细胞病毒产率要高一些，前者为7000∼12000 pfu/细胞，后者为5000 pfu/细胞. 但是由于贴壁面积的限制，总的病毒产量要低于悬浮培养[17].微载体对贴壁依赖型的细胞提供了更大的贴附表面积，Nadeau[17]评价了293细胞在不同的微载体系统的生长状况，认为Cytodex−3相对于其它的微载体是最优的. 但是293细胞本身的贴壁能力很弱，细胞很难在微载体间进行迁移.4.2 悬浮培养细胞相对于贴壁培养，悬浮培养更适于培养规模的放大，目前，对贴壁依赖型细胞进行改良，已第5期祁丽等：重组腺病毒生产技术研究进展477经建立了几种适于悬浮培养的细胞，如293，PER.C6®. 同时，无血清培养基的开发使得下游的分离纯化更容易.在批式悬浮培养中，293细胞和PER.C6®的最终细胞密度都可以达到3×106个/mL[12]，有些报道称293细胞的最终密度可达(7∼9)×106个/mL[18]. 批式培养操作比较简单，不用流加物质，所以染菌的机会较少. 在病毒感染后营养消耗很大，所以为了获得较高的病毒滴度，接种病毒后需要更换新鲜培养基.灌注可以提高细胞密度，也可以用于腺病毒的生产，灌注培养条件下，PER.C6®的最终细胞密度可以达到(7∼8)×106个/mL，也有人[19]建议用灌注的方法使细胞保持在很高的密度和营养状态，再进行病毒接种.表1列出了一些利用293细胞生产腺病毒的生产工艺数据和参数. 其中给出了用293细胞生产腺病毒载体常用的方法，除了用微载体培养外都是悬浮培养. 在进行病毒感染时除流加和灌注培养方式外，大部分方法都要更换培养基，保证包装病毒过程的营养需要. 在测定病毒产量时采用了不同的方法，所以，最终产量的表示方式不一样.表1 293细胞生产重组腺病毒载体的参数及数据Table 1 Data for production of adenovirus by cell 293Method V olume(L)MediaInoculation(×104 cell/mL)Infection(×105 cells/mL)MOI1)Harvest(d)Virus yield(×103 cell−1)Batch 3IS293-SF432110625vp Batch sparged[17] 3 IS293-SF 3 7.2 10654vpBatch cyto-3[20]2∼4 DMEM+10%FBS2)15 19∼22 5∼10 2∼3 3.6∼7.3 pfuBatch uspension[17] 2 293-SFMII 20 10 102 5.6ipFed-batch suspension[13] 3.5 NSFM13 30 10 10 2 1.6ip Perfusion suspension[12]0.5 DMEM+5%FBS 30 60 5 2.5 1.3ip/mLPerfusion suspension[13]10 293-SFMII 50 50 10 2 1.5ip/mLNote: 1) Multiplicity of infection; 2) Fetus bovine serum.5 重组腺病毒的纯化和计数方法重组腺病毒的纯化是大规模生产中的关键问题，病毒最经典的纯化方法是CsCl密度梯度离心，但是，这一工艺耗时并且放大困难. 为了满足基因治疗的需要，建立适用于大规模生产的纯化技术非常必要. Shabram等[21]使用了两步法，首先将粗提液通过DEAE阴离子交换柱，再通过羟基磷灰石柱进行吸附，这种方法是用于分离Ad2的，直接用于Ad5的分离需要改变分离的条件.Huyghe等[22]实验了阴离子交换树脂、体积排阻色谱、疏水色谱和固定化锌吸附色谱(ImmobilizedZinc Affinity Chromatography, IZAC)四种方法，总结出的优化方案为先通过DEAE阴离子交换柱，再通过固定化锌吸附色谱(IZAC)柱.在生产过程中病毒颗粒数和病毒滴度是两个非常关键的参数，这二者又与构建的病毒种类和宿主细胞种类有密切的关系. 准确的计数病毒可以检测纯化工艺的可靠性，通常所用的方法是生物检测，但是生物检测耗时长，操作复杂，而且对实验条件要求高，人为造成的误差大. 最早Maizel等人使用了OD260的方法，用SDS处理病毒后在260 nm测定其吸光度，再乘以消光系数就可以得到病毒颗粒数. 但是这一方法的精确度不能满足临床治疗的需要[21]. 为了满足临床的需要，人们尝试了各种方法. 表2列举了一些腺病毒的计数方法.其中病毒颗粒数包括具有感染效力的病毒和不具感染效力的病毒，在临床应用中一般采用总颗粒数来计算病人的接受剂量. 病毒滴度的测定是观察细胞感染病毒后的感染斑，是对具有感染效478 过程工程学报第4卷力的病毒的测定，为了保证临床应用的正确性，应该知道二者的比例，所以两种测定方法都非常关键. 感染滴度的测定与使用的生物材料和操作条件有密切的关系[28]. 由于病毒受到培养基体积的影响并不能充分感染细胞[27]，空斑法测定的结果偏低. 野生腺病毒的出现在临床应用中是非常危险的，从安全的角度出发，对它的检测非常关键.表2 常见的腺病毒载体计数方法Table 2 Common methods used for adenovirus quantitationTotal particle (vp)Titre (IU) RCAs Plaque assay Plaque assay and PCR TCID50 [28] Green fluorescent protein [29] OD 260Continuous bed matrix-HPLC [23]RP-HPLC [24]AE-HPLCPicoGreen fluorescent dye [25]Capillary zone electrophoresis [26]Electron microscope6 质量控制生产过程中野生腺病毒数的测定非常关键，通常是用敏感细胞的细胞致死效应来测定，比如：hela 细胞和A −549细胞，但是这种测定方法周期长，通常需要28 d. 现在更灵敏的方法是PCR.野生腺病毒的出现也促使人们去寻找更可靠的包装细胞株，如PER.C6®，但应用更多的还是293细胞. 对重组腺病毒的质量控制贯穿于整个生产纯化工艺，包括包装细胞、病毒、粗分离产品、纯化产品和最终产品. Roitsch 等[30]从稳定性、有效性和纯度三个方面详细报道了基因治疗中重组腺病毒的质量控制手段. 稳定性包括病毒基因组的稳定性和治疗基因表达的稳定性，前者的检测用酶切、电泳和Southern blot 等方法，后者的检测用ELISA 法. 有效性包括总病毒颗粒数与病毒滴度之间的比例和具有感染效力的病毒颗粒中治疗基因有效表达的比例，在临床治疗中病人接受的剂量用病毒总颗粒数表示，所以，上述两种比例就显得尤为重要，其中总颗粒计数用AE −HPLC 法，病毒滴度测定用免疫荧光法，外源基因表达检测用ELISA 法. 纯度包括RCAs 的检测、杂蛋白污染检测，RCAs 的检测用生物法和PCR 法，杂蛋白污染的检测用反相HPLC 和MALDI −TOF 质谱联用法.7 发展趋势与存在问题在过去几年中，新的腺病毒载体不断研制成功，对腺病毒载体的大规模生产工艺提出了迫切的要求. 尽管面临着很多困难，人们尝试了各种方法，通过腺病毒载体生产方式的改进，使重组腺病毒的大规模生产成为可能. 首先，随着各种适合悬浮培养的培养基的出现，从传统的贴壁细胞生产方式转向利用悬浮细胞培养方式；其次，另一个重要转变就是生产过程中无血清培养基的应用，传统的血清培养方式给下游的分离纯化工艺造成很大的困难，无血清培养基的应用大大简化了下游的纯化工艺；第三就是培养方式的改变，从批式培养到流加和灌注方法的应用，克服了细胞达到一定浓度后的营养缺乏，减少了副产物的产生. 总之，包装细胞的培养工艺逐渐转向无血清悬浮灌注培养方式，以增加细胞密度，提高病毒产量.由于目前大量的研究主要集中在包装细胞的培养工艺和腺病毒的纯化计数方法，对病毒在宿主细胞中的DNA 复制和成熟的机制知之甚少，最终提高病毒的产率和滴度以及完善流加和灌注工艺还有赖于对病毒复制与成熟机制的了解.第5期祁丽等：重组腺病毒生产技术研究进展479在整个重组腺病毒的生产纯化工艺中，纯化计数以及质量控制是比较薄弱的环节. 目前，虽然探索了不少的纯化计数方法，但是其中所用到的设备和材料价格昂贵，所以还有待进一步开发适合大规模纯化要求的设备和材料，或成本低廉的纯化工艺. 质量控制是生产中非常重要的一环，它应该包括两方面的内容，首先，它不仅是对最终产品质量的把关，还应该贯穿在整个生产过程中；其次，国内目前对于应用在临床的重组腺病毒载体还没有颁布相应的质量标准，甚至发达国家相关的质量标准也还很不完善，所以在质量标准的制定方面应加大研究力度，从而提高产品的治疗效果，减少副作用的发生.参考文献：[1] 顾健人，曹雪涛. 基因治疗 [M]. 北京：科学出版社, 2001. 1−54.[2] Trapnell B C. Adenoviral Vector for Gene Transfer [J]. Adv. Drug Deliv. Rev., 1993, 12: 185−199.[3] Danthinne X, Imperiale M J. Production of First Generation Adenovirus Vector: A Review [J]. Gene Ther., 2000, 7: 1707−1714.[4] Zhu J D, Grace M, Casale J, et al. Characterization of Replication-competent Adenovirus Isolates from Large-scale Productionof a Recombinant Adenovirus Vector [J]. Hum. Gene. Ther., 1999, 10: 113−121.[5] Lusky M, Christ M, Rittner K, et al. In Vitro and in Vivo Biology of Recombinant Adenovirus Vectors with E1, E1/E2A, orE1/E4 Deleted [J]. J. Virol., 1998, 72: 2022−2032.[6] Yeh P, Dedieu J F, Orsini C, et al. Efficient Dual Transcomplementation of Adenovirus E1 and E4-regions from a 293-derivedCell Line Expressing a Minimal E4 Functionnal Unit [J]. J. Virol., 1996, 70: 559−565.[7] Leopold P L, Ferris B, Grinberg I, et al. Fluorescent Virions: Dynamic Tracking of the Pathway of Adenoviral Gene TransferVectors in Living Cells [J]. Hum. 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To meet the need of experimental and clinical applications, 293 cell lines which include adherent cell line and suspension cell line are frequently used in production. Methods used in production include batch, fed-batch and perfusion. Quality control of recombinant adenovirus vectors is also very important in the process of production. This review summarizes the production process of adenovirus vectors, mainly concentrated on the adenovirus infection mechanism and methods of production, purification and quantification.Key words: gene therapy; recombinant adenovirus vector。

应用于兽用疫苗研发的病毒载体研究进展

ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ；ｖｅｔｅｒｉｎａｙｒｖａｃｃｉｎｅｓ；ｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｌｉｖｅｖｅｃｔｏｒｖａｃｃｉｎｅｓ
ｐａｐｅｒｒｅｖｉｅｗｓｍｏｓｔｏｆｔｈｅｖｉｒａｌ —ｖｅｃｔｏｒｂａｓｅｄａｎｔｉｇｅｎｄｅｌｉｖｅｒｙｓｙｓｅｌｏｐｅｄｆｏｒｖａｃｃｉｎｅ
随着分子生物学技术的发展和应用，疫苗的研
有实用性的载体。近２０年来，只有少数几种ＤＮＡ
病毒及ＲＮＡ病毒被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。
１ＤＮＡ病毒载体
制和开发取得了快速的发展。以重组病毒作为基
ｔｅｓｔｉｎｇｉｎｖｅｔｅｒｉｎａｙｒｓｐｅｃｉｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＤＮＡａｎｄＲＮＡｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｓｕｃｈａｓｐｏｘｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ，

重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定的开题报告

重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定的开题报告一、研究背景和意义腺病毒是一种广泛存在于哺乳动物中的DNA病毒，能够感染多种类型的细胞，具有高效的基因转导能力和良好的安全性。

因此，腺病毒已经成为了重要的基因转导载体，被广泛应用于基因治疗、基因工程和生物学研究等领域。

其中，重组腺病毒作为基因转导载体具有如下的优点：（1）能够稳定地表达外源基因：腺病毒具有较高的基因转导率，可以长时间稳定地表达外源基因，从而实现目标蛋白的大量表达。

（2）病毒颗粒结构复杂：腺病毒颗粒结构复杂，能够有效地包装外源基因，从而保证表达的效率和精度。

（3）有良好的生物安全性：腺病毒基因组不会整合到宿主细胞基因组中，从而减少对宿主基因组的影响，有良好的生物安全性。

本研究主要针对重组腺病毒载体pAd-CD的构建和鉴定展开，主要研究内容包括以下几个方面：1. 进一步优化pAd-CD载体的构建，提高其基因转导效率。

2. 针对pAd-CD载体的具体应用领域，开展针对性的效果评价和分析。

3. 探索pAd-CD载体在基因治疗、基因工程和生物学研究等方面的应用潜力。

本研究的开展能够拓展腺病毒在基因转导载体方面的应用范围，对基因治疗、生物学研究等领域具有一定的应用前景。

二、主要研究内容和研究方案1. 重组腺病毒载体pAd-CD的构建（1）提取并纯化腺病毒：采用经典的离心法等分离技术，从已知类型的腺病毒细胞株中提取并纯化腺病毒。

（2）选择并设计适合的pAd-CD载体：根据研究方向选择并设计适合的重组腺病毒载体。

（3）克隆外源基因：将目标基因与pAd-CD载体进行克隆，形成包含外源基因的载体。

（4）包装重组腺病毒：使用适当的技术和装置，将载体转化为重组腺病毒并包装成病毒颗粒。

2. 重组腺病毒载体pAd-CD的鉴定（1）DNA测序鉴定：使用合适的方法对构建出的pAd-CD载体进行测序鉴定。

（2）病毒包装率检测：测定包装率，评估重组腺病毒的制备质量。

（2）病毒的基因转导效率检测：采用不同的检测方法检测病毒的基因转导效率，分析重组腺病毒的基因转导效率及其影响因素。

新冠疫苗的研究进展

新冠疫苗的研究进展新冠病毒自2020年开始全球肆虐，各国纷纷加强科研力量，希望能尽快找到有效的疫苗来控制疫情的蔓延。

在这一场全球抗疫的战斗中，科学家们付出了巨大的努力，在不断的研究探索中取得了一系列疫苗研究的突破。

本文将对新冠疫苗的研究进展进行详细介绍。

一、传统疫苗的研究进展传统疫苗主要包括灭活疫苗、蛋白亚单位疫苗和载体疫苗三类。

灭活疫苗是通过将病毒灭活后注射给人体，刺激免疫反应，从而达到预防疾病的效果。

蛋白亚单位疫苗则是利用病毒的蛋白质部分，把其接种给人体，以激发免疫系统对该病毒的防御能力。

而载体疫苗则是将病毒的基因组嵌入其他无害病毒或者细菌中，经过基因工程的技术改造后，接种给人体，让人体产生特定的免疫反应。

二、mRNA疫苗的研究进展mRNA疫苗是近年来新兴的疫苗技术，其原理是通过注射人体细胞的合成mRNA，使得细胞能产生与新冠病毒蛋白相对应的蛋白质，进而促使免疫系统产生免疫反应。

mRNA疫苗的研究突破为新冠病毒疫苗的研发提供了全新思路。

目前，基于mRNA技术的新冠疫苗已经成功研发出多个品种，并在临床上取得了令人鼓舞的效果。

三、病毒载体疫苗的研究进展病毒载体疫苗是利用某些无害病毒或者细菌来携带新冠病毒的蛋白质基因，并将其注入人体，以达到激发免疫反应的目的。

当前研究中较为成功的载体疫苗是利用腺病毒来传递新冠病毒蛋白基因的疫苗，该疫苗已经完成了临床试验，并取得了良好的免疫效果。

四、重组蛋白疫苗的研究进展重组蛋白疫苗是通过将新冠病毒的相关蛋白基因导入到其他宿主细胞中，使其产生与新冠病毒相同的蛋白质，然后提取这些蛋白制作疫苗。

随着相关技术的不断提高，重组蛋白疫苗的研究也取得了长足的进展。

目前已有数种重组蛋白疫苗正在进行临床试验，并且有望早日投入使用。

五、疫苗研究面临的挑战虽然新冠疫苗的研究取得了重要突破，但仍然面临着一些挑战和难题。

首先，疫苗的研发需要较长的时间，包括临床试验和批量生产等环节，需要经历多个阶段的验证和审批。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(七)

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研
究与评价技术指导原则(七)
佚名
【期刊名称】《中国医药导刊》
【年(卷),期】2024(26)3
【摘要】六、质量研究与质量标准.1.质量研究.rAAV载体类产品的质量研究应根据产品的设计、作用机制和生产工艺等方面确定,一般包括(但不限于):鉴别、结构分析、一般理化特性、含量、纯度、生物学活性、杂质、污染物检测等。

研究样品应具有代表性,如工艺相近或相同的非临床研究用样品、临床试验用药品等。

质量研究信息应完整,包括分析方法原理介绍、研究样品、试验条件和基本步骤、数据处理和结果分析等,分析方法应能满足预期用途。

【总页数】1页(P284-284)
【正文语种】中文
【中图分类】R28
【相关文献】
1.感染靶向性重组腺相关病毒载体在基因治疗中的研究进展
2.重组腺相关病毒载体介导血管抑素基因治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究
3.生长激素缺乏性侏儒症基因治疗前瞻性研究:重组人生长激素非病毒载体基因治疗体内实验安全性观察
4.《单臂临床试验用于支持抗肿瘤药上市申请的适用性技术指导原则》(摘录七)
5.《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则(试行)》解读
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（）用脂质体作为转染介质构建人ＶＥ３采ＧＦ基因ｒＡＤ载体，大提高了转染效率］极。分裂期细胞和
静止期细胞。但外源基因表达水平低，易诱发机体产生免疫反应；２代腺病毒载体进一步去除了部第分或全部的Ｅ２基因或Ｅ４基因，除了产生复制型消
为由病毒介导的基因表达提供了更为安全可靠的载
ＷＴＣ — Ｐ的衣壳蛋白中插入一个ＰＣ — ／ＳＧＦｙＳＢ的抗原表位，壳修饰性腺病毒研制的多疫苗接种后，衣可
大幅提高小鼠的抗疟疾水平，得腺病毒介导的基使因表达的时问明显延长。Ｅｉｂｔ］ｌａｅｈ等系统地探ｚ
１腺病毒载体
不同类型血清型获得；除ＡＤ载体与ｃ消ＡＲ结合进
入细胞内的通路；与靶细胞表面特异性受体选现能
有的腺病毒大致可分为３代。第１代腺病毒载体主
要通过去除Ｅ、３区而获得，转染分择性结合。１Ｅ可
体渠道，制能高效转移基因、达高度组织特异研表性、精确控制表达的病毒载体迫在眉睫。利用病毒
载体可治疗一些特殊疾病，时探索病毒载体所面同临的安全性和毒性问题ｌ。目前研究最多的主要有＿ｌＪ
腺病毒载体、伪狂犬病毒载体、病毒载体、痘病慢鸡毒载体、５型腺病毒载体等。理想的病毒载体在人基因治疗、疫苗研制、疫病防控等领域的贡献不可估
量。本文对上述５种病毒载体的研究进展作一综述，旨在为开发出更安全、有效的重组病毒载体提更供参考。
腺病毒具有宿主范围广、整合人宿主细胞内、不插入外源基因大（７ｂ、同时表达多个基因且表３ｋ）能达水平高等优点，因此成为表达和传递治疗基因的
主要候选者。而腺病毒感染的广泛性，时也决定同
中图分类号：７文病毒载体是当今病毒基因工程研究的热点
组腺病毒载体产生的机体抗原特异性免疫反应，在
之一。载体是供插人目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。近年来，组病毒载体重
讨ＴＬ信号的细胞免疫应答和替代型与普通肌肉Ｒ
注射免疫小鼠产生重组腺病毒载体，究表明研Ｍｙ８Ｄ８的依赖的信号通路能有效改变其免疫原性。（）］２增强腺病毒靶向性，可更换病毒外壳采用
ＨＤＡｄ）］仅含有反向末端重复序列（Ｉｓ和包－ｌ，６ＴＲ）装信号（）载体容量达３ｋ，，７ｂ细胞毒性和免疫原性大幅减弱，目的基因的表达时间则大大延长。而然而，它需要有辅助病毒和互补细胞系才能够包装产生病毒粒子，即所谓的空壳载体，辅助病毒产量且很高，离困难，重组腺病毒产量比例为１：ｌ分与。因此，对第３腺病毒进行改良研究，代生产出安全高效，向性强，靶表达时间长并可调控的新一代腺病毒
行深入研究，已成为最有效的基因表达载体现
之一［。
腺病毒的可能性，比第一代具有更低的免疫原性和更大的载体容量；３代腺病毒载体又称辅助病毒第依赖型腺病毒载体（ｚｒＨｅｇａｅｏｉｕ，ｄｎｖｒｓ
了其缺乏靶向性，介导的转基因表达时间短，限其并
制其反复应用。由此可见，ｖ载体的免疫原性、Ａｄ
安全性和靶向性已成为其构建策略中改造的重点。
构建新一代腺病毒载体有如下目标：１降低重（）
＊家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放基金（ＫＩＢ０９Ｋ０４ＳＶＥ２ｏＫＦＴｌ、
中国人兽共患病学报
２４８ＣｈｉｅｅＪｕｒｌｏｎｓｎａｆＺｏｏｏｓｓｏｎｅ
文章编号：０２６４２１）３２４５１０ —２９（０２０ —０８ —０
重组病毒载体研究进展
王培园，李结，朱兴全杨桂连。袁子国，，
腺病毒（ｅｏｉｓＡｄ）于腺病毒科，Ａｄｎｖｒ，ｖ属ｕ线状、包膜的双链Ｄ无ＮＡ病毒，因组大小约３ｋ，基６ｂ
由２０个六邻体和１４２个五邻体构成二十面体病毒壳体。Ａｄｖ于１５９３年被病毒学家发现，此后不断进