酶的定向进化PPT课件
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酶Βιβλιοθήκη Baidu定向进化
• 利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转 化，已广泛应用于各个领域：医药方面、 食品工业方面、轻工、化工方面、能源开 发方面、环境保护方面等等
• 天然酶的局限：
• 酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶 学研究和工业化应用的要求
• 而且天然酶的稳定性差、活性低使催化效率很低 • 还缺乏有商业价值的催化功能，尤其是对一些非
• 利用基因工程原理在实验室中模拟生物进 化过程
– 化学进化 – 生物进化
• 生物的自然进化
➢ 进化过程：
突变→自然选择→遗传后代
➢ 进化结果：
基因多样性：为完成同一功能所表现出的 多个基因或同一个基因(同源基因，或同工酶)
代谢途径的多样性：同样产物，多条途径（木糖——木酮糖） 代谢产物的多样性：同一底物，不同产物 生物多样性：整个生态系统中的生物
随机突变+定向选择＝目标突变体
诱发突变的 因素
最适生长温度提高了！
细菌
最适生长温度为 370C
突变体库
50 0C培养
选择压力 （温度）
温度耐受型突 变体
– 属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解 酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的 进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基 因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并 定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。
试管中的进化是生物工程的未来
——诺贝尔奖获得者 M. Eigen
内容简介
• 酶定向进化简介：基本原理、研究历史 • 定向进化的策略：无性进化、有性进化、
同源重组 • 基因文库的构建与筛选：考虑要素、构建
策略、构建载体系统、文库筛选 • 定向进化应用 • 定向进化优势、现状和未来
1.研究历史
• 第一次在分子水平上定向改造单一分子的是 Sol Spiegelman 在20世纪60年代利用RNA噬菌体Q
• 优点：简便，随机突变丰富
• 缺点：正突变率低，突变基因文库大，筛 选工作量大。
• 适用于较小基因的定向进化
DNA 重组技术(DNA Shuffling)
1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段
• DNA改组具有以下有用的特征：
天然底物具有惰性
• 在非水环境下的低活力 • 对辅酶的依赖等
现代生物工程的要求
➢ 能具备长期稳定性和活性
➢ 能适用于水及非水相环境
➢ 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的 合成底物
➢ 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物 或药物的原材料
•如何利用相对简单的方法以达 到对天然酶的改造或构建新的 非天然酶就显得非常有研究意 义和应用前景
• 进化目标不同： 适应环境 超越生物学意义的要
求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。
• 酶分子定向进化
• 模拟自然进化过程(随机突变+自然选择)， 在体外对酶基因进行人工随机突变，建立 突变基因库，在人工控制条件的特殊环境 下，定向选择得到具有预先期望的具有某 些特性的酶的突变体的技术过程。
进行的一个实验，当时他的目的是为了证明达尔
文的自然选择也可以发生在非细胞体。此实验并 没有实际的应用价值
•
1981年，B.G.Hall等报道了他们定向改变大
肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，
开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。
•
1986年R。Hageman等进行了开发有效提高
常温生物中酶分子热稳定性的实验。
什么是定向进化技术
• 概念提出： • 1993年，美国科学家Arnold F H首先提出
酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶 的改造或构建新的非天然酶。
• 酶分子改造：
– 化学修饰，定点突变
• 定向进化
• 模拟自然进化的过程，进行人工随机突变， 并在特定的环境条件下进行选择，使进化 朝着人们所需方向发展的技术过程。
• ①它可以利用现存的有力突变，快速积累不同的 有利突变；
• ②重组可伴随点突变同时发生；
• ③可以删除个体中的有害突变和中性突变。
• 缺点：DNA改组过程中伴随的较高待点突变频率 会严重阻碍正突变组合的发现。由于绝大多数突 变是有害的，有利突变的重组和稀少有利点突变 会被有害突变的负背景所掩盖。
• DNA shuffling技术的改进
定向进化与自然进化的异同 点
➢ 定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸 和应用。
➢ 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化， 使进化朝着人们需要的方向发展。
➢ 两者的不同：
•进化动力不同： 保守突变 非保守取代；
•进化方向不同： 适应突变的积累；
•进化速度不同： 非常漫长 只需几年、甚至几天；
• 定向进化：突变 筛选
突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，
生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。
• 定点突变：
突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。
• 将对卡那霉素有抗性的卡那霉素核苷酸转 移酶基因转化进大肠杆菌，获得基因的突 变库
• 将突变库转入可以在高温下生长的耐热菌， 即嗜热脂肪芽孢杆菌中
• 通过在高温下进行筛选获得了一个在63℃ 下稳定的突变酶(Asp80Try)和一个在70℃
稳定的突变酶(Asp80Try，Thr130Lys)
2.基本原理
3. 定向进化的基本过程
• 随机突变 • 构建突变基因文库 • 定向筛选
3.1 随机突变
• 易错PCR技术
• DNA 重排技术(DNA Shuffling) • 基因家族重排技术
易错PCR技术
❖降低一种dNTP的量（降至5％-10％） ❖加入dITP来代替被减少的dNTP ❖缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ ❖提高Mg2+浓度
• 对酶分子的研究可以分为认识和改造两个 方面，前者是利用各种生物化学，晶体学 光谱学等方法对天然酶或其突变进行研究， 获得酶分子特征，空间结构和功能之间的 关系以及氨基酸残基功能等方面的信息， 以此为依据对酶分子进行改造，成为酶分 子的合理设计。如化学修饰，定点突变等。
澄清一个事实：定向进化不是定点突变
• 利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转 化，已广泛应用于各个领域：医药方面、 食品工业方面、轻工、化工方面、能源开 发方面、环境保护方面等等
• 天然酶的局限：
• 酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶 学研究和工业化应用的要求
• 而且天然酶的稳定性差、活性低使催化效率很低 • 还缺乏有商业价值的催化功能，尤其是对一些非
• 利用基因工程原理在实验室中模拟生物进 化过程
– 化学进化 – 生物进化
• 生物的自然进化
➢ 进化过程：
突变→自然选择→遗传后代
➢ 进化结果：
基因多样性：为完成同一功能所表现出的 多个基因或同一个基因(同源基因，或同工酶)
代谢途径的多样性：同样产物，多条途径（木糖——木酮糖） 代谢产物的多样性：同一底物，不同产物 生物多样性：整个生态系统中的生物
随机突变+定向选择＝目标突变体
诱发突变的 因素
最适生长温度提高了！
细菌
最适生长温度为 370C
突变体库
50 0C培养
选择压力 （温度）
温度耐受型突 变体
– 属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解 酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的 进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基 因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并 定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。
试管中的进化是生物工程的未来
——诺贝尔奖获得者 M. Eigen
内容简介
• 酶定向进化简介：基本原理、研究历史 • 定向进化的策略：无性进化、有性进化、
同源重组 • 基因文库的构建与筛选：考虑要素、构建
策略、构建载体系统、文库筛选 • 定向进化应用 • 定向进化优势、现状和未来
1.研究历史
• 第一次在分子水平上定向改造单一分子的是 Sol Spiegelman 在20世纪60年代利用RNA噬菌体Q
• 优点：简便，随机突变丰富
• 缺点：正突变率低，突变基因文库大，筛 选工作量大。
• 适用于较小基因的定向进化
DNA 重组技术(DNA Shuffling)
1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段
• DNA改组具有以下有用的特征：
天然底物具有惰性
• 在非水环境下的低活力 • 对辅酶的依赖等
现代生物工程的要求
➢ 能具备长期稳定性和活性
➢ 能适用于水及非水相环境
➢ 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的 合成底物
➢ 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物 或药物的原材料
•如何利用相对简单的方法以达 到对天然酶的改造或构建新的 非天然酶就显得非常有研究意 义和应用前景
• 进化目标不同： 适应环境 超越生物学意义的要
求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。
• 酶分子定向进化
• 模拟自然进化过程(随机突变+自然选择)， 在体外对酶基因进行人工随机突变，建立 突变基因库，在人工控制条件的特殊环境 下，定向选择得到具有预先期望的具有某 些特性的酶的突变体的技术过程。
进行的一个实验，当时他的目的是为了证明达尔
文的自然选择也可以发生在非细胞体。此实验并 没有实际的应用价值
•
1981年，B.G.Hall等报道了他们定向改变大
肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，
开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。
•
1986年R。Hageman等进行了开发有效提高
常温生物中酶分子热稳定性的实验。
什么是定向进化技术
• 概念提出： • 1993年，美国科学家Arnold F H首先提出
酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶 的改造或构建新的非天然酶。
• 酶分子改造：
– 化学修饰，定点突变
• 定向进化
• 模拟自然进化的过程，进行人工随机突变， 并在特定的环境条件下进行选择，使进化 朝着人们所需方向发展的技术过程。
• ①它可以利用现存的有力突变，快速积累不同的 有利突变；
• ②重组可伴随点突变同时发生；
• ③可以删除个体中的有害突变和中性突变。
• 缺点：DNA改组过程中伴随的较高待点突变频率 会严重阻碍正突变组合的发现。由于绝大多数突 变是有害的，有利突变的重组和稀少有利点突变 会被有害突变的负背景所掩盖。
• DNA shuffling技术的改进
定向进化与自然进化的异同 点
➢ 定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸 和应用。
➢ 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化， 使进化朝着人们需要的方向发展。
➢ 两者的不同：
•进化动力不同： 保守突变 非保守取代；
•进化方向不同： 适应突变的积累；
•进化速度不同： 非常漫长 只需几年、甚至几天；
• 定向进化：突变 筛选
突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，
生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。
• 定点突变：
突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。
• 将对卡那霉素有抗性的卡那霉素核苷酸转 移酶基因转化进大肠杆菌，获得基因的突 变库
• 将突变库转入可以在高温下生长的耐热菌， 即嗜热脂肪芽孢杆菌中
• 通过在高温下进行筛选获得了一个在63℃ 下稳定的突变酶(Asp80Try)和一个在70℃
稳定的突变酶(Asp80Try，Thr130Lys)
2.基本原理
3. 定向进化的基本过程
• 随机突变 • 构建突变基因文库 • 定向筛选
3.1 随机突变
• 易错PCR技术
• DNA 重排技术(DNA Shuffling) • 基因家族重排技术
易错PCR技术
❖降低一种dNTP的量（降至5％-10％） ❖加入dITP来代替被减少的dNTP ❖缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ ❖提高Mg2+浓度
• 对酶分子的研究可以分为认识和改造两个 方面，前者是利用各种生物化学，晶体学 光谱学等方法对天然酶或其突变进行研究， 获得酶分子特征，空间结构和功能之间的 关系以及氨基酸残基功能等方面的信息， 以此为依据对酶分子进行改造，成为酶分 子的合理设计。如化学修饰，定点突变等。
澄清一个事实：定向进化不是定点突变