培养基的灭菌

玻璃器皿的洗涤和包装

玻璃器皿的洗涤和包装

1. 玻璃器皿的洗刷：玻璃器皿的使用前必须洗刷干净。锥形瓶、试管、培养皿等浸入水中洗涤，用毛刷和洗衣粉洗刷，然后再用水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗。洗刷干净的玻璃仪器在电热干燥箱中烘干后备用。

2. 玻璃器皿灭菌前的准备工作：（1）培养皿又称双碟或平皿，由一底一盖组成一套。可以每套单独使用纸包装，也可将几套一起用纸包装；（2）移液管应在距管口约1-2毫米处用铁丝塞入少许棉花（约1-1.5厘米长）；以防止细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞的松紧适宜。炊时以能通气但不使棉花滑下为准。塞好棉花的移液管尖端，放在4-5厘米宽的长条纸的一端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。

3. 棉塞的制作

为了过滤空气，避免污染，试管或锥形瓶口需用棉花堵塞（脱脂棉易吸水，勿用）。为了节省棉花或节省时间，在配置实验临时所用的无菌水和培养基时，也可以用金属试管帽代替棉塞。装液体培养基的锥形瓶口，可包扎6-8层纱布以代替棉花。制作棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也

可借用玻璃棒塞入，也可以用折叠卷塞法制作棉塞（见图2-2）。

制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙浸入。棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，以瓶、管不下落为准。

图2-2 棉塞的制作过程

实验培养基的制备与灭菌

棉塞的2/3应在管内，上端露出1/3，便于提拔。如制作时不慎沾上培养基，则不可再用。在棉塞和平口外要包以厚纸，或将塞好后的试管集中放在铁丝筐内，上面盖以厚纸，用线绳扎好，准备灭菌，避免灭菌后冷水淋湿棉塞，并防止接种前培养基水分散失。上面配制好的各种培养基，分装于锥形瓶内和试管中，分别加以捆扎，做好标记。然后灭菌备用。

一、实验目的

1. 了解培养基的配制原理，掌握常用培养基的制备方法；

2. 学会玻璃仪器的洗涤和灭菌前的准备工作。

二、基本原理培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。任何培养基中均需含有微生物所必需的能源、碳源、氮源、矿质元素、水和生长因素，但不同营养类型、不同种类的微生物对营养元素的要求又有很大差异。不同微生物对PH值要求不一样，应将培养基调到一定的PH值范围。

根据研究目的的不同，可将培养基制成固体、半固体和液体三种形式。固体培养基是在液体培养基中加入1.52.0%的琼脂作凝固剂，半固体培养基则加入0.5-0.8%的琼脂。有时为了特殊的目的，也可用明胶或硅胶等作为凝固剂。

由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培养基。在分离、培养异养微生物时，对一般细菌常选用牛肉膏蛋白胨培养基，对放线菌常用高氏合成I号培养基，培养酵母菌、霉菌则用麦芽汁或豆芽汁葡萄糖培养基。

三、实验器材

1. 药品：牛肉膏；蛋白胨；氯化钠；琼脂；

2. 仪器及其他：试管；移液管；锥形瓶；烧杯；量筒；玻璃棒；漏斗；纱布；棉花；报纸；天平或台秤；等。

四、实验内容（一）常用培养基的配制

1. 肉膏蛋白胨培养基（用于分离及培养细菌）成分：牛肉膏0.5g；蛋白胨1.0g；氯化钠0.5g；琼脂1.5－

2.0g；水100mL；PH 7.0－7.2

1、配制培养基的基本过程如下：（1）称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于烧杯中；（2）溶解：在上述烧杯中加入所需水量（根据实验需要可加入蒸馏水或自来水）搅匀，加热溶解。应在药品全部溶解后加水补足加热过程所蒸发的水分。配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基煮沸，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全

融化，并不断搅拌，以免糊底烧焦，最后加水补足失去的水分；（3）调PH值：用1N NaOH或1N HCl调PH至7.2，尽量避免回调；（4）分装、包扎灭菌

注意：（1）牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后

倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速

（2）配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基煮沸，

再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全融化，并不断搅拌，以免糊底烧焦，最后加水补足失去的水分；或者将琼脂单独溶解再加入到已配好的培养基中

（3）调pH 检测培养基的pH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度

2. 斜面培养基制作法将已灭菌的装有琼脂培养基的试管，趁热置使成适当斜度，凝固后即成斜面（图2-3）。制得的斜面以稍有凝结水析出者为佳。如果制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好从中取出12管（瓶），放在30-37℃恒温箱中保温1-3天，不长菌者即证明灭菌已彻底，再放阴暗处保存。

图2-3 摆斜面

3、倒平板

（1）超净台紫外灭菌，溶化培养基（2）酒精清洁手（3）标记（4）打开三角瓶（5）左手拇指和食指打开培养皿上盖，右手托三角瓶瓶底，倒入约15mL左右（少于1/2）培养基，水平放置，使培养基平铺（6）待培养基凝固后，收起，常温培养检测无菌操作结果

五、实验报告

1. 分析你所配制培养基中的碳源、氮源、能源、无机盐及维生素的来源。

2.如何检查灭过菌的培养基是无菌的？

培养基的配制和灭菌

发布日期：2008-07-17 来源：生技网信息中心浏览次数：808

以1000 ml “MS + 3.0 mg/l NAA + 0.5%（即5 g/l）琼脂+ 3%（即30 g/l）蔗糖”为例。

第一步：准备好配制培养基的一切用具和试剂。

第二步：称量5 g琼脂和30 g蔗糖，溶解在大约所要配制培养基2/3~3/4左右体积（约600~750 ml）的（蒸馏）水中，加热溶解，不时搅拌，避免出现琼脂生块和泡沫。

第三步：根据用量，用量简或移液管从母液中取出所需量的大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素（每做1000 ml培养基，取20 ml大量成分、20 ml氯化钙母液、10 ml微量成分、10 ml铁盐母液和10 ml有机成分，以及3.0 mg NAA），放入预先有少量蒸馏水的烧杯中（以免加药液时溅出），然后加入琼脂和糖水溶液中搅拌混匀。

第四步：加水定容。待搅拌均匀后，用数滴稀碱（NaOH）将pH值调节到预定水平（一般为pH 5.8），当pH值偏碱时用稀酸（HCl）调节。用pH试纸或酸碱指示（或pH）计测定培养基的pH值。

第五步：将培养基用漏斗分装到培养容器中。每瓶加15~20 ml左右，之后加盖。

第六步：培养基进行灭菌。高压蒸气灭菌锅的温度为121℃，灭菌15~20分钟。

培养基常用高温高压（1.06 kg/cm2或0.1 MPa，121℃）蒸气灭菌的方法，灭菌时间应根据培养瓶体积大小及其内培养基容量多少而定（见表4）。体积和容量越大，所需灭菌时间就越长。空试管、空三角瓶和滤纸要在130℃下灭30分钟或121℃灭60分钟。空的培养容器不应同盛装培养基的培养容器一起高压蒸气灭菌，不同体积培养容器或盛装不同容量的培养基也不能一起高压蒸气灭菌，而应该分别进行。因为热穿透力是一个需要考虑的因素，体积大的培养容器需要较长的时间灭菌，是因为热量穿透大体积培养基要比体积小的花更多的时间。利用高压蒸气灭菌锅进行灭菌具有简单、快速，并且可以附带杀灭病毒又不吸收的优点（与过滤灭茵比较）。其缺点是会引起pH值的变化、发生化学变化和引起某些化合物的分解，使得某些培养基成分的活性丧失。高压蒸气灭菌会引起以下物质分解：蔗糖（分解为葡萄糖和果糖）、秋水仙素、玉米素（核甙）、赤霉酸（90%会丧失反应活性）维生素B1、B12、C