WT1基因与慢性肾脏病

综述
WT1基因与慢性肾脏病
一.概述：
WTl基因是于1972年Knudson A．G．Jr和Strong L．C调查研究了58个有家族性Wilms肿瘤史的家庭，发现在此类患者中多表现有11号染色体短臂的移位，即命名为wTl基因(肾母细胞瘤抑制基因)。

1990年由Call等人通过对WAGR综合症（表现为Wilms瘤，无虹膜，泌尿生殖器畸形和智力发育迟缓）患儿的定位克隆而分离鉴定出WT1基因。

WT1 基因位于11p13 ,由10 个外显子组成,外显子1～6编码转录调控区,外显子7～10 编码4 个锌指样DNA 结合区,是一种锌指样转录因子，对于肾脏及性腺发育具有重要作用,WT1 基因敲除的小鼠缺乏肾脏及性腺。

WT1 在胚胎早期组织内高度表达，而胚胎发育成熟后其表达仅局限于造血组织及肾脏，并且在成熟肾脏内特异性地表达于足细胞和包氏囊上皮细胞，系膜细胞、内皮细胞及肾小管管壁和肾间质均无表达。

WT1 是一种转录调控基因，对大量的基因表达具有调节作用,如编码转录因子PAX2、PAX8、NOVH 和WT1 基因本身,编码类胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板衍生生长因子A链(PDGF-A)、IGF-IF 、IGF-2、TGF-β1、EGR-1、CSF-1及其受体。

此外，WT1调节podocalyxin 、nephrin、Scel、Sulf1和bax-2 蛋白的表达水平。

WTl可与这些靶基因结合，调节其转录速度，从而调控细胞生长。

在此，我们重点了解慢性肾脏疾病中以下基因与WT1调节转录之间的关系。

二WT1与靶基因
1.Podxl
Podxl编码的Podocalyxin（PCX），为一种唾液酸化糖蛋白，是足细胞表面的主要负电荷物质，其通过接头蛋白(Adaptor protein)NHERF2及Ezrin与细胞骨架肌动蛋白连接，调节足突结构和功能。

在足突损伤时，podocalyxin与肌动蛋白的连接分离。

衬在足突的Podocalyxin通过静电排斥作用使相邻的足突分开、形成裂孔隔膜（slit diaphragm，SD），其特有的抗细胞相互黏附性维持了SD的完整性。

缺乏Podocalyxin的小鼠不能形成足突、裂孔隔膜，出生后24 h无尿并死亡。

高糖培养的人足细胞podocalyxin mRNA和蛋白表达均受抑制，STZ诱导糖尿病大鼠模型肾小球podocalyxin蛋白表达下调。

Podocalyxin在肾脏发育中的表达通过WT1调节，并有报道表明 podocalyxin的转录调节是Sp1结合位点支持的。

WT1结合于PCX基因启动子保守序列，从而有很强的转录激活力。

Palmer et al.［10］发现podocalyxin是WT1的直接下游区靶目标。

Drossopoulou GI et al.［3］通过观察长期培养于高糖环境下的人足细胞来研究WT1与podocalyxin之间的关系，发现25mM高糖下长期培养下的永生人足细胞的PCX蛋白和mRNA水平受抑制，而WT1保持不变。

说明高糖引起PCX损失与WT1蛋白降低不同步，WT1单独不能维持PCX表达。

人足细胞在高糖有或无时均表达WT1，而且WT1可以与另一个转录因子CRE结合蛋白（CBP）相互作用，而这种联系在25mM高糖存在时降低40%。

对25mM高糖培养下人足细胞染色质进行染色体免疫沉淀法，发现WT1结合PCX起始序列能力降低部分可能因为WT1-CBP相互作用的损伤。

将调节CBP和WT1联系的区域进行显性负性结构检测，发现WT1调节基因激活的可见性降低是剂量依赖性的。

因此，WT1-CBP相互作用的降低可能在长期暴露于高糖下抑制PCX表达、导致WT1结合PCX起始子可见性损伤方面起关键作用。

PINCH1，一种含有5个LIM（限制）区域的衔接蛋白，正常情况下定位于局部黏结位点。

Wang D et al.［2］发现PINCH1可作为一个转录调节因子，通过与核转录因子WT1相互作用来发挥功能。

WT1可以调节血小板衍生生长因子PDGF-α和TGF-β1的表达。

WT1通过富含GC的EGR-1抑制TGF-β1表达，而EGR-1与人TGF-β1启动子的DNA片段一致。

WT1突变的肾小球足细胞中的PDGF-α和TGF-β1过表达。

PINCH1由TGF-β1诱导表达，TGF-β1是一个纤维生成因子，促使足细胞功能障碍。

增多的PINCH1不仅定位于局灶黏附的位点，而且经TGF-β1刺激后会发生核易位，转移入细胞核内与WT1紧密连接。

PINCH1和WT1相互作用通过PINCH1的LIM1区和WT1的C 区锌指区域调节，从而导致足细胞中WT1调节的Podocalyxin基因表达抑制，同时PINCH1本身在荧光素酶启动子的作用下也抑制Podocalyxin的基因表达。

2.NPHS1基因
NPHS1基因位于19号染色体长臂13.1，长约26kb，含有29个外显子，该基因编码的蛋白 nephrin是一种跨膜蛋白，特异性表达在足细胞裂孔隔膜上。

当Nephrin与其配基结合时，可能导致细胞内酪氨酸残基磷酸化，从而具备信号转导的功能。

NPHSl发生突变可导致芬兰型先天性肾病综合征；Nephrin缺失的动物主要表现为足突缺失、无裂孔隔膜、新生儿死亡；动物实验表明，糖尿病大鼠随着肾脏损害的进展，Nephrin的表达也显著降低。

Doublier［15］等观察高糖环境下培养的人类肾小球足细胞表面特异性蛋白的表达，发现Nephrin呈斑点状表达，24 h 后明显降低，认为可能与转录下调有关。

糖尿病肾病患者肾组织内Nephrin、
Podocin、足细胞标记蛋白(Podocalyxin)的蛋白水平明显减少，而Nephrin、Podocin、Podoplanin的mRNA表达水平增加，也证实这一说法。

NPHS1表达显著下降的小鼠伴随有WT1蛋白表达水平的降低，表明nephrin是WT1下降引起的。

Gordon［16］等认为，人nephrin启动子的186bp序列在转基因小鼠足细胞的发育和成熟时能直接特异性调节基因转录。

将人NPHS1启动子的一段长约186bp片段置于转基因小鼠异源微小启动子前部，能决定β-半乳糖苷酶转录基因足细胞特异性的表达。

WT1在已分化的足细胞中与NPHS1协表达；凝胶电泳测定显示WT1蛋白重组体能以序列特异性方式结合并激活NPHS1186bp片段。

并且认为在nephrin启动子的83bp核心片段处存在WT1结合元件。

凝胶电泳显示重组体WT1（-KTS）能特异地与nephrin增强子结合。

另外，WT1在体外能激活nephrin-增强子的萤火素酶报告基因。

综上所述，WT1在体外调节NPHS1的表达。

3.PAX2
Pax2（Paired Box2)属于进化上高度保守的Paired Box Gene(pax)转录因子家族成员。

人类PAX2基因位于10q24-25，由12个外显子组成，长约70kb。

Pax2适量表达，通过促进细胞增殖及抑制凋亡，修复受损的小管、间质。

PAX2过度表达，细胞增殖与凋亡进一步减少，导致肾小管病理改变加重，使其对激素不敏感甚至耐药。

PAX2无效表达，导致肾、输尿管和性腺的缺失。

研究发现PAX2在肾组织损伤或功能丧失时可出现发育通路的回归表达，并在原发性局灶节段肾小球硬化及其他伴有局灶节段肾小球硬化的遗传性肾脏疾病、原发性肾病综合症和急性肾炎（AGN）、紫癜性肾炎足细胞中均可见PAX2再表达，说明其与足细胞病理发生及病理类型有一定关系。

有报道发现，WTl对PAX2的表达有负调控的作用，可能下调PAX2的表达，同样认为WTl是PAX2的上游基因。

然而，也有研究发现PAX2本身作为转录因子，能结合到DNA的某些部位，上调WTl的表达，从而认为PAX2是调控WTl表达的生理调节器，是WTl的上游基因。

Yang Y［25］发现病理情况下出现的PAX2的持续表达与重新分布，可导致WTl的转录抑制的失活和表达减少，通过抗凋亡、促细胞增殖、分化引起系膜细胞增殖。

Ohtaka ［20］发现WTl启动子上有PAX2的2个结合位点，由此推测PAX2是WT1表达的特定调节器。

近期更有体内及体外实验［17］证实PAX2和WTl之间存在着相互作用，它们可以形成一个复杂的分子复合体，调控彼此的表达。

4.Scel
Scel基因编码sciellin，它是一种皮肤上的编码角质化包膜蛋白，角质细胞外膜前体，其表达在Wt1+/mut肾小球内下调30倍多。

编码角质化包膜蛋白是一种
高度交叉连锁及有弹性的结构，仅在一些复层鳞状上皮分化细胞的血浆膜内侧。

认为它参加这些组织抵抗化学及生物学压力，提供保护性屏障。

它也在羊膜和大直径动脉内膜中表达，并在静脉动脉化时上调，提示它有压力耐受性。

Julien Ratelade等［4］第一次发现sciellin在小鼠和人的肾小球足细胞中表达，其基因是WT1的直接靶基因，其蛋白在Wt1+/mut肾小球内下调。

尽管还没有确定它在足细胞的亚细胞定位，但Sciellin在野生型小鼠肾小球毛细血管壁以准线性模式存在，与足细胞中nephrin表达信号协同定位。

并对sciellin和基底膜标志物巢蛋白进行二重定位，发现sciellin阳性细胞在GBM外侧，支持其定位在肾小球。

它与nephrin的共区域提示它可能部分定位在足细胞足突的裂孔隔膜处。

在它的信号平台作用下，推测裂孔隔膜参加调解毛细血管延伸引起的压力，增强组织对抗滤过压引起的张力，并有助于限制肾小球滤孔的大小。

有报道认为足细胞对机械性压力敏感，最近认为裂孔隔膜是一种压力感受器。

肾小球毛细血管压、交替改变的足细胞机械敏感性引起足细胞收缩功能异常，足细胞肥大和/或足细胞减少，最终导致肾小球硬化。

假设sciellin对上皮及动脉起作用，那么它在足细胞的压力承受方面发挥作用。

然而，它的下调并不仅在弥漫肾小球系膜硬化（DMS）时发生，事实上，它最大下调发生在B6×129突变小鼠，但并不发展为肾脏疾病。

另外，sciellin缺失的小鼠，其皮肤无结构或功能改变，并有正常肾脏组织。

足细胞sciellin下调可能是通过创造一个允许其他基因下调的环境来参加DMS的发展。

5.Sulf1
Sulf1基因编码6-O 内源性硫酸酯酶，在野生WT1足细胞中表达，并在突变时明显下调。

在中肾管细胞株中发现Wt1、Scel和Sulf1协同表达，通过siRNA 敲除WT1降低Scel和Sulf1的mRNAs及蛋白水平。

通过染色质免疫沉淀作用（CHIP）我们发现Scel和Sulf1是WT1的直接靶基因。

WT1可以与Scel和Sulf1基因的顺式作用元件相结合，调节其表达。

Julien Ratelade等［4］认为在Wt1+/mut小鼠Sulf1明显下调是低硫酸化HS链降低引起的，并通过调节生长因子信号在DMS中发挥作用，干扰由FGF激活的EPK/MAPK通路中几个基因的表达。

在Wt1+/mut肾小球内Sulf1表达明显下调，它的水平失调是压力依赖型的，并在敏感发展为DMS的FVB株更明显。

Sulf1与GBM硫酸乙酰肝素链低硫酸化有关，并能提前降低肾小球生长因子活性。

目前，对Sulf1在人肾脏疾病中的作用机制还须进一步研究。

三．结论
总之，WT1作为一种转录因子，对肾脏疾病的发生、发展、治疗及预后有密切关系，对上述基因与WT1基因相互关系的研究有助于我们进一步了解慢性肾脏疾病的发病机制，并为预防和治疗打开新思路。

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