急性肝损伤模型的建立

总结
目前选用鼠造模的较多,因鼠繁殖力强,生命力旺盛, 价格低廉;也有选用兔,因兔血容量大,肝脏大小适中,其肝 损伤易于生化及影像学观察。给药途径有多种,如皮下 注射、腹腔注射、灌胃、蒸气吸入或拌于食物中快速口 服等,优劣各家说法不一。灌胃法CCl4 经过门静脉系统 吸收,直接进入肝脏,模型制备理想,但操作复杂,肠道反应 , , , , 大;腹腔内注射门静脉浓度高,肝损伤形成时间短,但病死 率较高(20 %～35 %) ;皮下注射较腹腔注射具有如下缺 点,造模周期长,动物病死率高,相应增加了实验经费,因操 作不当可以发生皮下渗漏,但操作简便;蒸气吸入需快速 吸入,呼吸道刺激大,动物不耐受,中枢毒性大,易污染环境 和伤害实验人员;溶于少许食物快速口服,少吃多餐,挥发 减少,浓度低胃肠刺激减小,但受动物食欲影响,剂量难以 掌握,实验终点不明确,周期长。
建立模型方法
急性肝功能衰竭模型： a. 腹腔注射法：采用Wistar 或SD大鼠，重 200±10g，约20只大鼠。实验组：用四氯化碳 (CCl4 ) 溶于精致植物油, 配成浓度为10%、 20%或更高40%的四氯化碳 ，予3-10ml/kg分 组腹腔注射给药，12～24h（更早或更晚）后 处死动物。取材，检测指标。 对照组：予相同 剂量的精致植物油腹腔注射，余同上。 b.皮下注射法：颈背部或后肢外侧皮下注射， 拔针是要注意药液外漏。 c.灌胃染毒法：试验前对动物隔夜禁食。
四氯化碳性肝损伤的机制
1 引起氧化应激 氧化应激在CCl4 引发肝 损伤的早期发挥着重要作用。 (1)引起自由基变化; (2) 引发与COX介导的炎症反应相关; (3) 导致肝星形细胞活化。
2 引起体内相关酶系变化 (1) 转氨酶上升。CCl4 引发肝实质损害时,天冬氨酸 转氨酶和丙氨酸转氨酶活力升高,且酶活力的高低 与肝细胞受损的程度相一致。 (2) 酶性抗氧化物改变。它们具有强烈的清除自由基 的作用,且互相依赖和支持,形成网络式的抗氧化酶 系统来拮抗CCl4 对肝脏造成的损伤。 (3) 细胞色素P450 酶系改变。CYP450 酶在CCl4 肝损伤发生过程中起到了十分重要的作用,以 CYP2E1 最为受到关注。
实验目的
1.掌握四氯化碳对肝脏的毒性机理，成功建 立其急性肝损伤模型。 2.熟悉建模过程中的各个环节，并能解决相 关问题，真正感受造模的过程，为将来真 正进入实验做铺垫。
四氯化碳性肝损伤的机制
关于CCl4 肝毒的作用机制,存在多种假设,但都一致公认,其主要 机制是自由基的形成及引发的链式过氧化反应。CCl4在体内可经 肝微粒体细胞色素P450 代谢激活,生成两个活性自由基(CCl3O2 和Cl) 及一系列氧活性物,可与肝细胞质膜或亚细胞结构的膜脂质 发生过氧化反应,膜磷脂大量降解,从而破坏细胞膜结构完整性,引 起膜通透性增加,最终导致肝细胞死亡。另外,CCl4 的代谢产物能 迅速与细胞成分如胞内脂质、蛋白、核脂质、核蛋白和DNA 等 多种大分子发生不可逆的共价结合而导致细胞死亡,特别是当自 由基作用于DNA 时,损伤核糖和碱基,使核酸直接破坏引起DNA 链的断裂或DNA 链与蛋白间交联,影响其信息传递功能以及转录 和复制特性。在CCl4代谢产物引起的脂质过氧化物和共价结合的 双重作用下,导致膜脂质流动性降低、钙泵抑制、谷胱甘肽活性 抑制、肝微粒和线粒体功能丧失、肝细胞内钙稳态失调及代谢紊 乱,引起肝细胞损伤加剧 。
四氯化碳性肝损伤的关键点
1.急性肝损伤是一个短期过程，一般在1248h内成模，因此，分组建模、取材、标本 固定的时间安排等很重要。 2.腹腔注射CCl4溶液，要注意进针部位、深 度。对给药浓度和剂量，因为鼠源不同或 相关文献数据的不一致性，可以分组进行 不同剂量、浓度的对比性实验。 3. 在制模过程中可以加入戊巴比妥或乙醇代 替饮水，以加速肝损伤进程。
大鼠急性肝损伤的动物模型
前景
• 目前,肝损伤动物模型的复制主要有生物性、免疫 性、化学性等方法,生物学方法要求实验条件高且 费用昂贵,限制了应用。 • 免疫方法是造成免疫肝损伤,主要用于通过免疫机 制而抗肝损伤的药物研究。如：卡介苗(BCG) 加 脂多糖(LPS) 诱导法 、刀豆蛋白A 诱导法。 • 化学方法则是通过化学性肝毒物质,如四氯化碳、 氨基半乳糖、硫代乙酰胺、黄曲霉素等致肝损伤。 • 这里我们以四氯化碳性肝损伤 四氯化碳性肝损伤模型的建立来浅谈 四氯化碳性肝损伤 一下。
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毒性基因组学变化 近年来,国内外很多学 者运用基因芯片技术对CCl4 的毒性机制进行 了探讨,初步形成了CCl4 的基因组学研究体系。 CCl4急性肝损伤实验表明,6 和24 h 是CCl4 的损伤阶段,而48 h 至2 周则是CCl4 后引发损 伤后的自我修复阶段；CCl4 慢性肝损伤试验 表明,30～60 d阶段作为脂肪变性期,60～90 d 为肝纤维化形成期。
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改变细胞因子活性 CCl4 引发机体产生 的脂质过氧化产物,如丙二醛和42羟基壬醛, 可引发转化生长因子2β1、TNF2α,白细胞 介素等细胞因子的高表达,后者在CCl4 诱导 的肝纤维化的过程中发挥着重要作用。
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引起细胞凋亡 CCl4引发机体产生的自 由基的代谢紊乱会引起脂质过氧化产物的 积累,进而促进肝细胞的直接死亡或者凋亡。 其中,羟基自由基是促使肝细胞凋亡的重要 体内物质。CCl4 引发肝细胞凋亡的机制复 杂,一般认为都是通过激活死亡受体实现的。 另外,CCl4 也可引起肝星形细胞的凋亡。 CCl4 可激活核因子2κB ,引起细胞凋亡。
成模的标准
（1）血液：测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT) 、天 门冬氨酸氨基转移酶(AST) 、总胆红质(TB) 、总 蛋白(TP) 、白蛋白(A)血清等。 a.肝组织样品处理 血清:以3500 转/ 分离心 15～20min ,取上清夜低温保存,于一周内检测完. b. 肝样:取011g 加1mL 生理盐水匀浆,以3500 转 / 分离心15～20min ,取上清夜低温保存,于一周内 检测完. （2）组织病理学检查 取材：a.时间：分组给药后3h、6h、12h、24h。 b.固定：取肝脏将其固定于4 %（10%）甲 醛中, 经常规脱水, 石蜡包埋, 切5µm 厚切片, 常规 HE 染色、Masson 染色和Ret2culin 染色, 光镜下 观察 。