急性肝损伤模型的建立
建立急性肝损伤模型
一、四氯化碳急性肝损伤模型[造模原理]四氯化碳(CCl4 )是无色透明液体,不溶于水.CCl4的毒性主要与其活性代谢产物有关.在肝内CCl4惊NADPH和肝微粒体细胞色素P450混合功能氧化酶的作用,生成活泼的三氯甲基自由基和氯自由基.这些自由基能与细胞内和细胞膜上大分子发生共价结合,引起富含不饱和脂肪酸的生物膜发生脂质过氧化,导致膜结构和功能完整性的破坏,肝细胞损伤坏死.三氯甲基自由基还能抑制细胞膜和微粒体膜上该泵的活性,食Ca2+内流增加,从而引起细胞中毒死亡;三氯甲基自由基能与蛋白质形成共价键,损害线粒体,使还原型辅酶Ⅰ(NADH)及ATP在肝内生成减少,脂肪酸氧化抑制,影响肝脏能量生成障碍,并使三酰甘油和脂肪酸在肝细胞内蓄积.[实验动物]体重18-22g的小鼠、体重150-180的大鼠或体重4-45kg的家兔.[操作方法]用CCl4 在不同动物可以多种方法引起急性肝损伤.一般用花生油将CCl4 稀释为所需浓度. CCl4 致急性肝损伤所需剂量和用法见表8-1[模型评价与注意事项]1.( CCl4肝损伤模型是最常用的急性肝损伤模型,造模方法简单,成功率高,重复性好，价格低廉。
2．CCl4剂量不宜过大，以免造成动物中毒死亡。
3：CCl4是无色澄清的有毒液体，有特殊气味，难溶于水。
CCl4 一般用花生油、橄榄油、豆油等植物油混合成所需浓度，有时也可与矿物油(如液体石蜡)混合。
以植物油为例，10％CCl4的配制方法是：取5ml植物油和5g阿拉伯胶，置于乳钵中研匀，再加lOml纯CCl4。
研匀，然后加蒸馏水lO~15ml调成乳状，最后加蒸馏水至lOOml，用前摇匀。
4．用CCl4复制肝损伤模型的主要缺点是,不同动物个体肝损伤的程度差异较大. 还有研究表明，小鼠接受CCl4后肝脏病理学改变与血清ALT等生化指标改变的相关性不如大鼠好。
5 CCl4 液体和蒸气可以从呼吸道、皮肤吸收,对人体有一定毒性，操作时应注意防护.二、D-半乳糖胺急性肝损伤模型[造模原理]D-半乳糖胺(D-galactosamine)引起急性肝损伤的机制尚不完全清楚。
LPS_D_GalN诱发NF_B_省略_因小鼠急性致死性肝损伤模型的建立_潘庆军
Establishment of a NFκB transgenic mouse model of acute lethal liver injury induced by LPS / DGalN
PAN Qingjun 1 ，ZHU Xuezhi 2 ，LIU Yuan
3
（ 1． Affiliated Hospital of Guangdong Medical College， Zhanjiang 524001， China； 2． Guangdong Yuehai Feed Group Co． ， Ltd． ， Zhanjiang 524017 ； 3． Li Ka Shing Faculty，University of Hong Kong，Hong Kong 999077 ） 【Abstract】 Objedtive To establish a NFκB transgenic mouse model of acute lethal liver injury induced by
檵檵檵檵殝
［4 ， 5 ］
。该
2
中国实验动物学报 2013 年 8 月第 21 卷第 4 期
Acta Lab Anim Sci Sin， August， 2013 ， Vol． 21. No． 4
损伤的发病机理、 治疗策略与药物筛选。 研究发现 ， 急性肝损伤模型建立后血清中 ALT 和 AST 显 著 升 高 ， 反 应 肝 脏 代 谢 功 能 的 指 标： TBIL、 DBIL 和 IBIL 也显著升高 ， 反映肝脏合成功 能的凝血 酶 原 时 间 也 显 著 延 长
。
DGalN 本实验在增加 LPS（ 500 μg / kg） 的剂量， （ 800 mg / kg ） 采用常规剂量时， 在 NFκB 转基因小 ＲEＲEluc （ Oslo ） 上成功建立了一个急性 κB鼠 NF致死性肝损伤模型， 旨在建立一个极端的重症肝损 也可为内毒素血症或败血症合并肝衰竭的 伤模型， 研究提供参考。
常用急性肝损伤动物模型研究进展
常用急性肝损伤动物模型研究进展肝脏是人类重要的代谢器官，承担着维持生命的重要功能，还有解毒、造血和凝血作用，其中一些有损肝脏的物质也必须依靠肝脏解毒，故肝损伤的发生率极高，肝病的防治工作刻不容缓。
寻找一种较为适合的肝损伤模型是进行肝病防治研究的必要前提，目前常用的肝损伤模型有化学性、免疫性、酒精性还有其他类肝损伤模型。
本文将近几年常用的各种急性肝损伤的动物模型进行综述，为选择合适的造模方法提供思路。
标签：急性肝损伤;动物模型;方法化学性肝损伤四氯化碳（CCl4）。
四氯化碳是最常用的致化学性肝损伤的药物，其特异性高，能够有效造成肝脏发生脂质过氧化反应。
CCl4进入体内后，能够在肝药酶的催化作用下产生自由基，与细胞膜上的大分子物质共价结合，产生脂质过氧化反应，破坏细胞膜的结构和功能。
周迎春[1]给小鼠灌胃1% CCl4（0.1 ml/10 g），24h后建立小鼠急性肝损伤模型，该模型重复性好，具有强烈的肝毒性，能使血清中ALT、AST含量迅速升高，是理想的造模药物。
但CCI4挥发性强，可经多途径传播吸收，对实验人员有一定的危害。
对乙酰氨基酚（AP）。
AP是目前临床常常用的解热镇痛药，但长期过量应用，会造成肝损伤疾病。
AP在体内代谢产生的N-乙酰对苯醌亚胺（NAPQI）可与肝细胞内生物大分子共价结合，影响蛋白质的正常生理功能。
吴洋东等[2]给昆明种系小鼠一次性腹腔注射AP 200mg/kg，40h后造成急性肝损伤模型，AP 可造成肝损伤而不会损害其他组织器官，模型重复性好，是常用的肝损伤模型。
D-氨基半乳糖（D-GaIN）。
D-氨基半乳糖（D-GaIN）可对肝细胞磷酸尿嘧啶产生干扰，可以损害质膜，形成肝细胞内复合物，消耗尿苷三磷酸，使肝细胞出现炎症和弥漫性坏死，其病理变化与病毒性肝炎相似。
王超等给小鼠一次性腹腔注射10% D-GalN 生理盐水溶液，剂量为600 mg /kg ，16h后造成急性肝损伤模型。
低温环境诱导下急性大鼠肝损伤模型的建立
低温环境诱导下急性大鼠肝损伤模型的建立【摘要】目的：1.建立-10℃低温冷冻箱环境下急性大鼠肝脏损伤模型；2.研究冷刺激诱导下急性肝脏损伤的机制；方法：建立-10℃低温环境诱导下的急性大鼠肝损伤模型，通过检测大鼠血清中ALT、AST等指标的变化，观察大鼠肝脏病理的改变，以研究低温环境诱导下大鼠急性肝损伤的发生机制。
结果：经过2h、4h、6h进行低温暴露后，4h模型组ALT、AST水平对比正常组升高明显，具有显著统计学意义（P＜0.01），实验数据表明，大鼠4h冷暴露后造模成功，且6h冷暴露后大鼠肝功仍能维持一定的损伤的程度。
结论：本实验建立了一种操作方便，易复制的低温环境诱导下急性大鼠肝损伤模型。
【关键词】低温环境；急性肝损伤；大鼠模型；机制本实验通过将大鼠置于-10℃低温冷冻箱环境中建立急性肝细胞损伤大鼠模型，连续观察大鼠分别于2h、4h、6h后血清检验指标ALT、AST等指标，并进行病理学检测以确定大鼠肝细胞损伤造模成功时间，以及不同冷暴露时间下肝细胞损伤及凋亡的情况，为探讨冷刺激诱导下肝脏损伤的机制，并为对比中、西药在改善冷刺激诱导下急性肝细胞损伤时的疗效评估提供依据。
资料与方法1.材料：采用清洁雄性大鼠75只，体重约180-220g，来源于山东大学动物实验中心，室内温度22℃±1℃，采用12小时光照，12小时黑暗循环动物房。
适应性饲养一周后，随机分为2组，正常温度组（N=15），冷暴露组(N=60)，冷暴露组分为实验组（N=45）、造模组（N=15）,并将冷暴露组大鼠置于-10℃低温冷冻箱中，造模组冷暴露前7天灌服蒸馏水，冷暴露组大鼠分别暴露时间为2h、4h、6h三个时间点，每个时间点20只大鼠，每个铁丝网笼放5只大鼠，造模期间可适当进食、水，正常温度组放置于22±1℃的环境中，造模期间正常饮食。
2.标本采集2.1 血清学检测于2h、4h、6h分别处死2h模型组、4h模型组大鼠、6h模型组大鼠。
四氯化碳致小鼠急性肝损伤模型建立与考察
基金项目!河南省科技创新人才计划C杰出青年项目"%&)%""&%""!"$%国家-十三五.科技重大专项课题"!"%'RU%"$!&&"+C""!$ 作者单位!%"""(#北京解放军总医院第五医学中心中医肝病科"付双楠#宫?$%河南中医药大学"高达#郭佳佳#苗明三#朱平生$ 通信作者!朱平生#!"#$%!LE)8$,65E+,6! %!+*(G"%宫?#!"#$%!6G,6"#,("!!%+(*(G"
期间自由饮水(摄食#第'天开始联苯双酯组以&*+!& "6+96灌胃#空 白 对 照 组 及 模 型 组 灌 胃 等 剂 量 蒸 馏 水#每天%次#连续灌胃$'%第%&天腹腔注射"*%? 浓度 44=) 橄榄油溶液制备急性肝损伤模型#分别于 造模后((+(%!和!)E后处理各组动物#以%"?水合 氯醛按"*"( "=+%"6麻醉动物#摘眼球取血#) \# )""";+"$,离 心 %& "$,#取 血 清#采 用 全 自 动 生 化 分 析仪测各组生化指标 2=K 及 2IK'
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肝损伤实验报告（论文资料）
急性肝损伤对药物作用的影响【目的】1、学习制作CCl4肝损伤模型。
2、观察肝损伤时对地西泮药效的影响。
3、观察肝损伤时肝脏大体病理形态的改变。
4、检测肝损伤时肝脏谷丙转氨酶（ALT）的活性。
【器材】紫外可见光分光光度计1台，恒温振荡水浴器1台，台式高速离心机1台，小鼠笼及饮水瓶2套，组织剪1把， 1ml注射器3只，250ml烧杯1只，一次性试管（5ml）6支，试管架4个，1.5mlEP管8个，苦味酸1瓶，冰块1盆，鼠料1包，垫料1包。
【药品】20% CCl4溶液，地西泮注射液，ALT（谷丙转氨酶）检测试剂盒，生理盐水200ml，蒸馏水100ml。
【动物】雄性昆明小鼠8只，体重25~30克。
【方法】每组4只小白鼠，饲养于同一鼠笼中。
2只作为对照；2只作为CCL4肝损伤模型动物，以苦味酸号标记。
1、CCl4肝损伤动物模型的制作：模型组小白鼠腹腔注射0.1ml/10g 的20%CCl4溶液，对照组小白鼠腹腔注射0.1ml/10g的生理盐水。
饲养过夜。
2、CCl4肝损伤对地西泮催眠作用的影响：24h后，取对照组和模型组小白鼠各1只，分别腹腔注射5mg/ml地西泮50mg/kg。
观察并记录其入睡时间（翻正反射消失时间）。
3、肝脏大体病理形态观察：入睡小鼠颈椎脱臼处死，取肝脏，观察大体病理形态（颜色、结构等变化）。
4、血清制备：取对照组和模型组小白鼠各2只，断头取血，收集到EP管中，静置10分钟，4000rpm离心10分钟，取上清50ul，稀释10倍为待测样品。
5、血清ALT测定：ALT活性计算公式：C样=（A样/A标）× C标C：浓度（活性单位U/L），A：吸光度值， C标为100 U/L【结果】1、CCl4肝损伤对地西泮催眠作用的影响（数据以x±s表示，做组间t检验）实验组别地西泮入睡时间（S）生理盐水组215.40±70.47CCl4肝损伤组59.35±14.89t检验过程:（1）建立检验假设，确定检验标准H0：μ1=μ2,两组不同处理实验小鼠注地西泮后入睡时间的总体均数相同H1：μ1≠μ2,两组不同处理实验小鼠注地西泮后入睡时间的总体均数不相同ɑ=0.05（2）计算检验统计量由原始数据计算得：n1=20,∑X1=4308 ∑X²1=1027254 ¯X1=215.4n2=20,∑X2=1187 ∑X²274885 ¯X2=59.35运用统计学公式计算得：S²c=(n1-1)S²2+(n2-1)S²2/（n1+n2-2）=2730.19S¯x1-¯x2=16.5233算得t=|¯X1-¯X2|/S¯x1-¯x2=9.444(3)确定P值，作出推断结论V=n1+n2-2=38；查t界值表得，t0.05/2,38=2.024,t0.01/2,38=2.712,本例t> t0.01/2,38,P<0.01，差异有统计学意义,拒绝H0，接受H1，故可认为CCl4肝损伤对地西泮催眠作用有影响。
四氯化碳致急性肝损伤的原理
四氯化碳致急性肝损伤的原理及模型建立一些肝毒索已经成功地应用于肝衰竭的诱导。
目前常用的肝毒素主要有D．Gal、醋氨酚、CCl4等。
D．Gal肝损伤模型的病理改变与人类病毒性肝炎的病理改变较为接近，肝外毒性不明显，剂量范围易控制，但有潜在的不可逆性，同时因为D．Gal价格昂贵，大型动物猪或犬建立模型时所用剂量较大，重复率并不十分理想，也无临床相关的药物中毒，所以限制了它在大型动物造模方面的应用。
CCl4是一种对肝细胞有严重毒性作用的化学物质。
目前认为其导致肝损伤的主要机制与四氯化碳自身和其自由基代谢产物有关，、CCl4在肝内经细胞色素P450 2El代谢产生毒性代谢产物。
CCl4自身的溶酶作用可导致肝细胞损伤，但这仅限于高浓度的CCl4。
CCl4的自由基导致肝损害的过程被认为是主要的机制。
榍文海等报道用杂种犬，将cache与等量花生油混合溶液，以0．9ml／kg一次腹腔注射建立犬暴发性肝功能衰竭模型。
结果，注射CCl4后犬里进行性肝功能衰竭表现，第72 h血丙氨酸转氨酶、总胆红素、血氨明显升高，凝血酶原时间延长，血糖降低，(均P<0．01)；脑电图检查出现异常波型。
第7d病理检查显示：肝细胞大片溶解坏死，网状支架大部分存在，肝细胞轻度增生。
暴发性肝功能衰竭形成率为93．0％。
动物48～96h死亡率73．O％，14d内肝损害明显恢复。
动物一般表现，实验室及组织学检查表明，整个动物染毒过程，近似于人类的急性暴发性肝功能衰竭过程。
本模型具有以下特点：①动物受损后，经充分的时间，可以恢复到用药前水平，模型具有可逆性；②受损动物以72h为死亡高峰，第5d开始恢复，终点十分明确；③实验动物肝功能衰竭时间与死亡时间有一定间隔，具有适用性和可控制性；④CCl4经济可行，注意保护，对实验人员毒性不大，较为安全。
亚急性和慢性毒性：动物吸入400ppm，7小时/天，5天/周，173天，部分动物127天后勤部死亡，肝肾肿大，肝脂肪变性，肝硬化，肾小管上皮退行性病变。
急性肝损伤模型的建立
四氯化碳性肝损伤的关键点
1.急性肝损伤是一个短期过程，一般在1248h内成模，因此，分组建模、取材、标本 固定的时间安排等很重要。 2.腹腔注射CCl4溶液，要注意进针部位、深 度。对给药浓度和剂量，因为鼠源不同或 相关文献数据的不一致性，可以分组进行 不同剂量、浓度的对比性实验。 3. 在制模过程中可以加入戊巴比妥或乙醇代 替饮水，以加速肝损伤进程。
实验目的
1.掌握四氯化碳对肝脏的毒性机理，成功建 立其急性肝损伤模型。 2.熟悉建模过程中的各个环节，并能解决相 关问题，真正感受造模的过程，为将来真 正进入实验做铺垫。
四氯化碳性肝损伤的机制
关于CCl4 肝毒的作用机制,存在多种假设,但都一致公认,其主要 机制是自由基的形成及引发的链式过氧化反应。CCl4在体内可经 肝微粒体细胞色素P450 代谢激活,生成两个活性自由基(CCl3O2 和Cl) 及一系列氧活性物,可与肝细胞质膜或亚细胞结构的膜脂质 发生过氧化反应,膜磷脂大量降解,从而破坏细胞膜结构完整性,引 起膜通透性增加,最终导致肝细胞死亡。另外,CCl4 的代谢产物能 迅速与细胞成分如胞内脂质、蛋白、核脂质、核蛋白和DNA 等 多种大分子发生不可逆的共价结合而导致细胞死亡,特别是当自 由基作用于DNA 时,损伤核糖和碱基,使核酸直接破坏引起DNA 链的断裂或DNA 链与蛋白间交联,影响其信息传递功能以及转录 和复制特性。在CCl4代谢产物引起的脂质过氧化物和共价结合的 双重作用下,导致膜脂质流动性降低、钙泵抑制、谷胱甘肽活性 抑制、肝微粒和线粒体功能丧失、肝细胞内钙稳态失调及代谢紊 乱,引起肝细胞损伤加剧 。
异烟肼灌胃建立小鼠急性肝损伤模型的研究_禄保平
·论著·异烟肼灌胃建立小鼠急性肝损伤模型的研究禄保平，杨晓娜，许家艳【摘要】目的探索应用异烟肼灌胃建立小鼠急性肝损伤模型，并初步阐明其机制。
方法昆明种小鼠 50 只，随机分为异烟肼正常剂量造模组（常量组）、2 倍剂量造模组（2 倍量组）、5 倍剂量造模组（5 倍量组）、8 倍剂量造模组（8 倍量组）和空白对照组，每组各 10 只。
各造模组分别以 90、180、450、720 mg/kg 剂量的异烟肼灌胃，18 h 后检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平并取肝组织进行光镜观察，探索导致明显急性肝损伤的相对合适剂量。
另取昆明种小鼠 90 只，随机分为单纯造模组（40 只）、干预造模组（40 只）和空白对照组（10 只），各造模组以相对合适剂量异烟肼灌胃，其中干预造模组于造模前以甘利欣75 mg/kg 体重连续灌胃 5 d，18、36、54、72 h 后分别检测血清 ALT、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧物酶（GSH-Px）水平，并进行肝组织光镜和电镜观察，探索导致明显急性肝损伤的相对合适时间及可能机制。
结果在探索相对合适剂量实验中，2 倍量组小鼠血清ALT、AST 分别为（101.6 ± 6.3）和（108.1 ± 14.9）U/L，明显高于空白对照组的（30.1 ± 3.6）、（35.3 ± 6.5）U/L 和常量组的（52.8 ± 5.3）、（53.9 ± 8.9）U/L，差异均有统计学意义（均P < 0.05），肝细胞出现广泛的脂肪变性和水肿，肝窦几乎消失；5 倍量组小鼠死亡 7 只，8 倍量组小鼠则全部死亡。
在探索相对合适时间及发生机制实验中，应用2 倍剂量异烟肼灌胃后 18 h，单纯造模组小鼠血清 ALT、MDA 水平明显高于空白对照组，SOD、GSH-Px 水平明显低于空白对照组，肝细胞广泛损伤，细胞超微结构显著变化。
急性肝损伤大鼠肝组织HSP60的变化及意义
急性肝损伤大鼠肝组织HSP60的变化及意义急性肝损伤大鼠肝组织HSP60的变化及意义引言急性肝损伤是一种常见的严重疾病，其特点是发病急、进展迅速、病情重，严重威胁患者的生命健康。
研究表明，在急性肝损伤过程中，炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等因素都与肝脏损伤及修复过程密切相关。
热休克蛋白60（HSP60）是一种重要的细胞应激蛋白，其在细胞损伤和炎症反应中发挥重要作用。
本文将探讨急性肝损伤大鼠肝组织HSP60的变化及其意义。
急性肝损伤大鼠肝组织HSP60的变化1. 急性肝损伤模型的建立在实验室中，以大鼠为研究对象建立了急性肝损伤模型，常用方法包括钩端螺旋硬脂酸（D-gal）注射法、亚硝酸钠注射法等。
通过这些方法，可以有效地诱导急性肝损伤，模拟疾病发生的过程。
2. HSP60的表达水平通过免疫组化和免疫印迹等技术检测肝组织中HSP60的表达水平。
结果显示，在急性肝损伤大鼠肝组织中，HSP60的表达呈明显上调态势。
这说明在急性肝损伤过程中，HSP60扮演着重要的修复和保护作用。
急性肝损伤大鼠肝组织HSP60的意义1. HSP60的保护作用HSP60在急性肝损伤过程中表达上调，可能是为了应对损伤引起的细胞应激反应。
研究发现，HSP60可以通过抑制凋亡信号通路的激活、调节氧化应激反应等途径发挥保护作用。
因此，HSP60的上调可能是肝组织对损伤的一种自然反应，旨在减轻细胞损伤。
2. HSP60与炎症反应的关系急性肝损伤常伴随着炎症反应的激活，而HSP60与炎症有密切关联。
研究发现，HSP60可以激活免疫细胞，并促进炎症因子的释放，从而引发炎症反应。
然而，适度的炎症反应对于修复和保护肝组织具有一定的作用。
因此，HSP60在肝损伤中的上调可能与炎症反应的调节有关。
3. HSP60与肝细胞再生的关系急性肝损伤过程中，肝细胞再生是一种重要的修复机制。
研究表明，HSP60在肝细胞再生过程中发挥着重要作用。
HSP60可以通过调节信号通路的激活和抑制，促进肝细胞的增殖和分化。
大鼠急性酒精性肝脑损伤模型的建立
大鼠急性酒精性肝脑损伤模型的建立刘青青;李永儒;李高婷;刘浪飘;杨一;彭云;杨艳【摘要】目的:探索建立简便有效的大鼠急性酒精性肝脑损伤动物模型.方法:将SD 大鼠随机分成对照组和模型组,模型组大鼠以52°白酒进行灌胃,第1天的灌胃剂量为7ml/kg,随后1周的灌胃剂量为10ml/kg,对照组灌胃等体积水.实验结束后,对大鼠进行体重增长幅度、肝指数计算,检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性、甘油三酯(TG)含量及肝脑组织中丙二醛(MDA)含量、总超氧化物歧化酶(SOD)活性,脑组织中钙离子(Ca2+)含量、ATP酶活性.结果:与对照组比较,模型组大鼠的体重增长幅度显著降低,血清中ALT、AST和TG显著升高,肝指数、肝脑组织MDA含量显著升高,而SOD活性显著降低,脑Ca2+含量显著升高、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显降低(P<0.001).结论:实验成功有效地在短时间内建立了大鼠急性酒精性肝脑损伤模型,可应用于护肝醒脑保健食品药品的评价研究.【期刊名称】《医学理论与实践》【年(卷),期】2018(031)016【总页数】3页(P2373-2375)【关键词】急性酒精性肝脑损伤;大鼠;动物模型【作者】刘青青;李永儒;李高婷;刘浪飘;杨一;彭云;杨艳【作者单位】西南医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室,四川省泸州市646000;西南医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室,四川省泸州市646000;西南医科大学公共卫生学院预防医学专业;西南医科大学公共卫生学院预防医学专业;西南医科大学公共卫生学院预防医学专业;西南医科大学公共卫生学院预防医学专业;西南医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室,四川省泸州市 646000【正文语种】中文【中图分类】R575酒精性肝损伤又称酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)是由于长期大量饮酒所致的慢性肝病。
肝损伤模型的建立
肝损伤模型的建立：1. 四氯化碳体外损伤肝细胞模型原代培养的正常大鼠肝细胞培养24h（贴壁良好）后，置培养皿于一密闭的塑料盒，内置四氯化碳0.4M容积，37度90min，造成肝细胞损伤的模型，后转入正常培养，进行下一步实验。
(即熏蒸法)肝细胞培养12h后，吸弃上清，更换培养液并加入CCL4 8mM（事先用DMSO溶解，DMSO终浓度1％），作用6h后收集24孔板中培养上清检测AST以及肝细胞MDA含量盒GSHpx活性，评价损伤程度。
（常用方法）2.醋氨酚体外损伤肝细胞模型肝细胞培养24h后，用清洗液洗2次，培养液洗1次，然后换以20mM醋氨酚的培养液，继续培养12h，取培养液，进行下一步实验。
3.过氧化氢体外损伤肝细胞模型肝细胞培养24h后，吸弃上清液，更换培养液并加入H2O2 0.6mM，作用1h后，收集24孔板中的培养上清液检测AST活性和MDA含量。
4.氰化钾缺氧肝细胞损伤模型肝细胞培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入氰化钾2.5mM，继续培养2h，定量检测培养液上清中LDH活性，以及酶的活性反应肝细胞损伤程度。
本模型可以更好的模拟缺氧损伤。
5.硫代乙酰胺（TTA）体外肝细胞损伤模型肝细胞预培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入TTA0.18mM，继续培养48h，肝细胞大量损伤和坏死，上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性升高，造成体外损伤肝细胞模型。
6.内毒素体外损伤肝细胞模型贴壁生长良好的肝细胞中加入内毒素70uL/mL，置37度，5％CO2培养此时上清LDH 活性升高造成肝细胞损伤模型，造成体外肝细胞损伤模型。
7.半乳糖胺（GalN）体外损伤模型分离肝细胞，预培养12-24h后，待细胞贴壁生长均匀后，加入5mMGalN的肝细胞培养液，继续培养1.5h，测定培养上清液中ALT，ALT显著升高时，肝细胞造模成功。
2.体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）1大鼠肝细胞的分离和培养大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。
急性肝损伤研究
急性肝损伤动物模型研究进展目前，国内外对肝损伤的防治仍是一个严峻课题。
选择合适的肝损伤模型是做好防治肝损伤研究的前提。
通过建立实验性肝损伤动物模型，研究肝病的发生机制，筛选保肝药物，探索保肝作用原理，具有十分重要的现实意义。
本综述将目前应用较多的模型做一列举分析。
一、化学性肝损伤1. 四氯化碳肝损伤CCl4是一种常用的诱发化学性肝损伤模型的剧毒类化学药物之一，因其接触后发病率高。
易在动物实验中复制，能准确反映肝细胞的形态学变化，在研究保肝降酶药的实验中经常使用[1]。
CCl4引起肝损害的主要机制是CCl4经肝微粒体细胞色素P450(Cyt1 P450)活化后生成三氯甲基自由基(·CC13) ，在其启动的过氧化连锁反应中，生毒性作用更强的二氯甲基自由基(·CC12)及过氧化甲基自由基(·OOCC13) ,这些自由基攻击肝细胞膜的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid ,PUFA) 引发脂质过氧化[2]。
CCl4溶于植物油，配制0.1 %-0.2%浓度，按10 ml/kg小鼠腹腔注射，或灌胃0.1 %～0.2 %，或皮下注射0.5 %，12～24 h 内处死动物。
测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)等反应肝功能的指标；肝匀浆超氧化物歧化酶(SOD)，脂质过氧化物(LPD)或丙二醛(MDA)等反映脂质过氧化的指标，肝脏取同一部位进行组织病理学检查。
此模型是肝损伤的经典模型，应用最多，能准确反映肝细胞的功能、代谢及形态学变化，重复性好。
但缺点是CCl4还同时损害动物的其他多种脏器，此外，CCl4 挥发性较大，可经人体多种途径吸收，故对实验人员具有一定的中毒危险性。
2. D-半乳糖胺肝损伤D-半乳糖胺（D-GalN），又名D-氨基半乳糖，是一种肝细胞磷酸尿嘧啶核苷干扰剂，可造成肝弥漫性坏死和炎症，与临床病毒性肝炎的肝脏病理变化相似。
实验37小鼠急性肝损伤模型的建立与测定
肝损伤测定结果
01
肝功能指标
02
肝脏病理学检查
03
肝脏代谢指标
通过测定小鼠血清中谷丙转氨酶 （ALT）、谷草转氨酶（AST） 等肝功能指标，评估肝损伤程度。
通过组织切片和显微镜检查，观 察肝脏的病理变化，如肝细胞坏 死、炎症等。
测定小鼠肝脏中代谢相关指标， 了解肝脏的代谢功能变化。
结果分析方法
统计分析
手术损伤
通过手术手段造成肝脏局部缺血或损伤，如肝部分切除术、门静脉结扎 等。这种方法对动物损伤较大，且操作较为复杂，一般不常用。
03
其他方法
还有其他一些方法如免疫损伤、病毒诱导等也可以用来建立急性肝损伤
模型，但应用相对较少。
掌握测定肝损伤的方法
生化指标检测
通过检测动物血清中的转氨酶、胆红素等生化指标，评估肝脏功能和损伤程度。这些指标 的变化可以反映肝脏细胞的损伤情况。
急性肝损伤的病理生理过程
01
急性肝损伤是由于各种原因引 起的肝脏细胞短时间内大量死 亡或功能丧失，导致肝脏结构 和功能的严重损害。
02
常见的病因包括药物性肝损伤 、酒精性肝损伤、肝炎病毒感 染等。
03
病理生理过程包括炎症反应、 氧化应激、细胞凋亡和坏死等 。
建立急性肝损伤模型的原理
01
通过给予实验动物具有肝毒性作 用的物质，如CCl4、D-半乳糖胺 等，可诱发急性肝损伤。
病理学检查
对动物肝脏进行病理学切片和染色，观察肝脏组织的形态学变化，如炎症细胞浸润、肝细 胞坏死等。病理学检查是评估肝脏损伤程度和诊断肝脏疾病的重要手段。
其他检测方法
除了生化指标检测和病理学检查外，还可以采用其他一些方法如免疫学检测、分子生物学 检测等来评估肝脏损伤程度和探索发病机制。
改良法大鼠急性肝损伤模型建立的研究2126
由饮水 ， 仍禁食。
假手术 组 ：０只， ｌ 手术方式同模型组 ， 但腹 腔 内注射生
理 盐 水 ０２ ／Ｏ ｇ开 腹 后 不 进 行 部 分 肝 叶 切 除 术 ， 腹 后 ． ｌＯ ， ｍｌ 开
造模组大 鼠胆 酶值均高于对照组 ，说 明其具备 了急性
肝 损 害 动 物 实 验要 求 ，是 一 种 可 行 高效 的实 验 模 型 建立 方
２１ ０ ０年 ６月 下 第 ２卷 第 １ ２期
Ｊｎ ｕｅ
１ ２ ２ ０ ０１ Ｖｏ． Ｎｏ １ ．２
中 国 中 医 药 咨 讯
Ｊ ｕｎ ｌｏ ｉａＴｒｄｉｏ ａ ｉｅｅＭｅ ｉｉ ｆｒ ｔｏ ｏ ｒａ ｆ Ｃｈｎ ａ ｔ ｎ ｌ ｉ Ｃｈｎ ｓ ｄｃｎｅＩ ｏｍａｉｎ ｎ ・１ ５ ・ ７
三氯 甲烷 自由基 （ Ｃ ３ ， Ｃ Ｌ ）使得蛋 白合 成障碍 ， 且使得脂质 分解代谢紊乱［ 并且可 引起细胞膜的变性损伤 以及酶渗漏 ２ １ 。 等 细胞病变 以及 坏死 ［ ３ １ 。本实验按 ０２ｍ ／ ０ ． Ｌ１ ｇ体重给予 ０ ２ ％（ 积 比） ＣＡ 植物 油溶液腹腔 内注射制作 急性化学 ５ 体 ＣＩ 性肝损伤模型［】在此基 础上行肝部分切除术 ， ４。 存活率决定 于受化学损伤的残肝 的代偿能力。此 种方法所得 的肝损伤
１ 实 验 动物 及 试 剂
观无 明显变化 ， 呈棕红色 ， 颜色均匀一致 ， 光泽度好 ， 腹腔内
无腹水 。
成年、 健康 、 洁级雄 性体重 １０ ２ ０ 雄性 ｓ 清 ８— ５ ｇ Ｄ大 鼠 ２ ０只 ， 清洁级 ， 由沈阳军区总院实验动物中心提供 。实验操 作遵循《 实验动物学》 的有关规定。动物在实验 前在实验室
差 异无 统 计 学 意 义 。
小鼠急性酒精性肝损伤模型的制备及观察
小鼠急性酒精性肝损伤模型的制备及观察林晓晖;黄玲;王一铮;刘如玉【摘要】Objective:To establish an alcohol-induced acute liver injury model in mice and to dynamically monitor the changes of biochemical indexes in serum and liver. Methods :Eighty ICR mice were randomly divided into eight groups, four control groups and four model groups. The model groups were given 52%(V/V)alcohol with 12ml·kg-1d-1 by gastric perfusion while the control groups were given distilled water. At 2, 4, 6, 8 days after administration, a model group and a control group were respectively sacrificed to take serum samples for measurements of ALT and TG levels, and liver samples for measurements of liver index, TG, SOD and MDA levels. Results:After treating for 6 days, serum ALT and TG levels were significantly increased(P<0.01), and liver index, TG and MDA level in liver tissue were increased significantly(P<0.01), whereas SOD level in liver tissue decreased significantly(P<0.01). Conclusion :A mice model of alcohol-induced acute liver injury has been successfully established, which is stable and can be used for studying the mechanism of drug protectionin alcoholic liver disease.%目的：建立小鼠酒精性肝损伤模型，并动态研究小鼠血清和肝脏的生化指标的变化。
四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤模型的建立和优化_朱安妮
1.3 方法 1.3.1 CCl4橄榄油溶液的配置 用微量移液器分别 取50、100、150 μl CCl4加入50 ml橄榄油，混合均 匀，配置体积分数为0.1%、0.2%、0.3%的CCl4橄榄 油溶液，于通风橱操作，现用现配。 1.3.2 比较不同浓度CCl4对小鼠血浆转氨酶水平的影 响 将182只C57BL/6小鼠随机分出32只。将32只小 鼠随机分为正常对照组和浓度为0.1%、0.2%、0.3%的 CCl4实验组，每组各8只。采用不同浓度的CCl4橄榄油 溶液，对实验组小鼠进行单次腹腔注射（10 ml/kg）， 正常对照组给予等体积的橄榄油作为对照。注射 后12小时取外周血，置于EDTA-Na2抗凝管颠倒混 匀，2000 r/min，离心20分钟，分离血浆，全自动 生化分析仪测定小鼠血浆中ALT、AST的水平。 1.3.3 观察0.1%和0.2% CCl4组小鼠不同时间点血浆 转氨酶水平的变化 将剩余的150只C57BL/6小鼠随 机分为正常对照组（10只）、实验Ⅰ组（70只）和 实验Ⅱ组（70只）。将实验Ⅰ组小鼠随机分为7个 亚组（各亚组每组10只），以0.1% CCl4橄榄油溶 液，按照10 ml/kg剂量对各亚组小鼠进行单次腹腔 注射，分别于注射后6、12、16、20、24、48、72 小时取血，检测小鼠血浆中ALT、AST的水平，方 法同1.3.2。实验Ⅱ组小鼠以0.2% CCl4橄榄油溶液腹 腔注射，亚组时间点的选取及操作同实验Ⅰ组。正 常对照组小鼠给予等体积的橄榄油溶液，单次腹腔 注射，取血操作同前。 1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对数据进行统 计分析，符合正态分布的计量资料以x- ± s表示，
急性肝损伤是指病毒感染、肝毒性药物、有 毒物质和肝缺血再灌注等因素[1]导致的急性肝脏功 能异常，是临床上多种急性肝病共同的病理基础， 严重或持续的损伤最终可导致肝硬化甚至肝功能衰 竭[2,3]。四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）诱导 的肝损伤模型广泛用于肝坏死及肝硬化的病因学、 组织学和肝功能变化的研究以及对保肝药物、药用 植物提取物的评价[4,5]。目前国内多采用SD大鼠和 封闭群小鼠进行CCl4急性肝毒性实验，选取的染毒 途径、剂量、时间点等因素也多有不同。近交系 C57BL/6小鼠，因其有表现型的一致性、遗传的稳 定性以及此背景下试剂和抗体的广泛性等特点，可 以为今后进行免疫学相关的研究打下基础。本研究 通过给予C57BL/6小鼠单次腹腔注射CCl4造模并检 测血浆转氨酶水平，摸索最适造模剂量，为下一步 药理学、免疫学以及临床治疗等后续相关研究提供 可靠的参照依据。 1 材料与方法 1.1 实验动物 选择野生型C57BL/6小鼠182只，雄 性，6～8周龄，体重18～20 g，购于中国医学科学 院动物所，饲养于中国医学科学院0007）。 1.2 主要试剂和设备 CCl4（分析纯，成都市科龙化 工试剂厂，批号20120220）；橄榄油（分析纯， 成都市科龙化工试剂厂，批号20130513）；低温 多用途离心机（德国Thermo公司，型号Megafuge 1.0R）；全自动生化分析仪（日本日立公司，型号 7600-020）。
急性肝衰竭模型构建及细胞移植途径初探
南华大学学报・医学版 ($)*+,% $- ’,+.), /+012*3045 （ 62708,% 97040$+）
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急性肝衰竭模型构建及细胞移植途径Байду номын сангаас探
刘? 芳， 陈少红， 范新娟， 唐? 芳， 赵国强 （ 中山大学 中山医学院 病理教研室， 广东 广州 G=;;H; ） 摘? 要：目的 ? 优化急性肝衰竭模型的构建方法， 探讨细胞移植的最佳途径。方法 ? 以 I A 氨基 半乳糖胺 （ I A C,%） 作为肝脏毒剂， 构建雌性 JI 大鼠急性肝衰竭模型。以病理形态学和多项血生化指 标综合评估肝功能损伤的状态， 确定模型构建的最优方案。以此为基础， 通过脾内和腹股沟静脉两种途 径植入雄性 JI 大鼠的骨髓间质干细胞 （ K6JL3 ） 。以 3*5 基因为分子标志， 采用 MLN 技术检测植入细 胞在肝脏内的存活状态， 并对两种不同的植入途径综合评估。结果 ? （ = ） 不同剂量的 I A C,% 可导致不 同程度的肝损伤， 而 =& " C O PC 剂量较好地模拟了急性肝衰竭的病理生理改变且稳定性较好。 （:） 移植 后 Q R !; 天在两组细胞移植组大鼠肝脏内均能检测到 3*5 基因阳性细胞的存在， 而相应对照组未能检 测到 3*5 基因阳性细胞的存在。结论? （ = ） I A C,% =& " C O PC 腹腔注射可以很好构建 JI 大鼠急性肝衰竭 模型。 （:） 骨髓间质细胞经腹股沟静脉移植和脾内移植均可在受体肝脏内存活至少 = 个月。经腹股沟 静脉进行移植是治疗大鼠急性肝衰竭的一种较好的途径。 关键词：骨髓间质干细胞； ? 肝衰竭； ? 细胞移植 中图分类号： NGQG? ? ? 文献标识码： S? ? ? 文章编号： =<Q: A Q""" （ :;;< ） ;" A ;"H: A ;G
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建立模型方法
急性肝功能衰竭模型： a. 腹腔注射法：采用Wistar 或SD大鼠，重 200±10g，约20只大鼠。实验组：用四氯化碳 (CCl4 ) 溶于精致植物油, 配成浓度为10%、 20%或更高40%的四氯化碳 ，予3-10ml/kg分 组腹腔注射给药，12～24h（更早或更晚）后 处死动物。取材，检测指标。 对照组：予相同 剂量的精致植物油腹腔注射，余同上。 b.皮下注射法：颈背部或后肢外侧皮下注射， 拔针是要注意药液外漏。 c.灌胃染毒法：试验前对动物隔夜禁食。
四氯化碳性肝损伤的机制
1 引起氧化应激 氧化应激在CCl4 引发肝 损伤的早期发挥着重要作用。 (1)引起自由基变化; (2) 引发与COX介导的炎症反应相关; (3) 导致肝星形细胞活化。
2 引起体内相关酶系变化 (1) 转氨酶上升。CCl4 引发肝实质损害时,天冬氨酸 转氨酶和丙氨酸转氨酶活力升高,且酶活力的高低 与肝细胞受损的程度相一致。 (2) 酶性抗氧化物改变。它们具有强烈的清除自由基 的作用,且互相依赖和支持,形成网络式的抗氧化酶 系统来拮抗CCl4 对肝脏造成的损伤。 (3) 细胞色素P450 酶系改变。CYP450 酶在CCl4 肝损伤发生过程中起到了十分重要的作用,以 CYP2E1 最为受到关注。
成模的标准
（1）血液：测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT) 、天 门冬氨酸氨基转移酶(AST) 、总胆红质(TB) 、总 蛋白(TP) 、白蛋白(A)血清等。 a.肝组织样品处理 血清:以3500 转/ 分离心 15～20min ,取上清夜低温保存,于一周内检测完. b. 肝样:取011g 加1mL 生理盐水匀浆,以3500 转 / 分离心15～20min ,取上清夜低温保存,于一周内 检测完. （2）组织病理学检查 取材：a.时间：分组给药后3h、6h、12h、24h。 b.固定：取肝脏将其固定于4 %（10%）甲 醛中, 经常规脱水, 石蜡包埋, 切5µm 厚切片, 常规 HE 染色、Masson 染色和Ret2culin 染色, 光镜下 观察 。
大鼠急性肝损伤的动物模型
前景
• 目前,肝损伤动物模型的复制主要有生物性、免疫 性、化学性等方法,生物学方法要求实验条件高且 费用昂贵,限制了应用。 • 免疫方法是造成免疫肝损伤,主要用于通过免疫机 制而抗肝损伤的药物研究。如：卡介苗(BCG) 加 脂多糖(LPS) 诱导法 、刀豆蛋白A 诱导法。 • 化学方法则是通过化学性肝毒物质,如四氯化碳、 氨基半乳糖、硫代乙酰胺、黄曲霉素等致肝损伤。 • 这里我们以四氯化碳性肝损伤 四氯化碳性肝损伤模型的建立来浅谈 四氯化碳性肝损伤 一下。
总结
目前选用鼠造模的较多,因鼠繁殖力强,生命力旺盛, 价格低廉;也有选用兔,因兔血容量大,肝脏大小适中,其肝 损伤易于生化及影像学观察。给药途径有多种,如皮下 注射、腹腔注射、灌胃、蒸气吸入或拌于食物中快速口 服等,优劣各家说法不一。灌胃法CCl4 经过门静脉系统 吸收,直接进入肝脏,模型制备理想,但操作复杂,肠道反应 , , , , 大;腹腔内注射门静脉浓度高,肝损伤形成时间短,但病死 率较高(20 %～35 %) ;皮下注射较腹腔注射具有如下缺 点,造模周期长,动物病死率高,相应增加了实验经费,因操 作不当可以发生皮下渗漏,但操作简便;蒸气吸入需快速 吸入,呼吸道刺激大,动物不耐受,中枢毒性大,易污染环境 和伤害实验人员;溶于少许食物快速口服,少吃多餐,挥发 减少,浓度低胃肠刺激减小,但受动物食欲影响,剂量难以 掌对肝脏的毒性机理，成功建 立其急性肝损伤模型。 2.熟悉建模过程中的各个环节，并能解决相 关问题，真正感受造模的过程，为将来真 正进入实验做铺垫。
四氯化碳性肝损伤的机制
关于CCl4 肝毒的作用机制,存在多种假设,但都一致公认,其主要 机制是自由基的形成及引发的链式过氧化反应。CCl4在体内可经 肝微粒体细胞色素P450 代谢激活,生成两个活性自由基(CCl3O2 和Cl) 及一系列氧活性物,可与肝细胞质膜或亚细胞结构的膜脂质 发生过氧化反应,膜磷脂大量降解,从而破坏细胞膜结构完整性,引 起膜通透性增加,最终导致肝细胞死亡。另外,CCl4 的代谢产物能 迅速与细胞成分如胞内脂质、蛋白、核脂质、核蛋白和DNA 等 多种大分子发生不可逆的共价结合而导致细胞死亡,特别是当自 由基作用于DNA 时,损伤核糖和碱基,使核酸直接破坏引起DNA 链的断裂或DNA 链与蛋白间交联,影响其信息传递功能以及转录 和复制特性。在CCl4代谢产物引起的脂质过氧化物和共价结合的 双重作用下,导致膜脂质流动性降低、钙泵抑制、谷胱甘肽活性 抑制、肝微粒和线粒体功能丧失、肝细胞内钙稳态失调及代谢紊 乱,引起肝细胞损伤加剧 。
3
改变细胞因子活性 CCl4 引发机体产生 的脂质过氧化产物,如丙二醛和42羟基壬醛, 可引发转化生长因子2β1、TNF2α,白细胞 介素等细胞因子的高表达,后者在CCl4 诱导 的肝纤维化的过程中发挥着重要作用。
4
引起细胞凋亡 CCl4引发机体产生的自 由基的代谢紊乱会引起脂质过氧化产物的 积累,进而促进肝细胞的直接死亡或者凋亡。 其中,羟基自由基是促使肝细胞凋亡的重要 体内物质。CCl4 引发肝细胞凋亡的机制复 杂,一般认为都是通过激活死亡受体实现的。 另外,CCl4 也可引起肝星形细胞的凋亡。 CCl4 可激活核因子2κB ,引起细胞凋亡。
四氯化碳性肝损伤的关键点
1.急性肝损伤是一个短期过程，一般在1248h内成模，因此，分组建模、取材、标本 固定的时间安排等很重要。 2.腹腔注射CCl4溶液，要注意进针部位、深 度。对给药浓度和剂量，因为鼠源不同或 相关文献数据的不一致性，可以分组进行 不同剂量、浓度的对比性实验。 3. 在制模过程中可以加入戊巴比妥或乙醇代 替饮水，以加速肝损伤进程。
5
毒性基因组学变化 近年来,国内外很多学 者运用基因芯片技术对CCl4 的毒性机制进行 了探讨,初步形成了CCl4 的基因组学研究体系。 CCl4急性肝损伤实验表明,6 和24 h 是CCl4 的损伤阶段,而48 h 至2 周则是CCl4 后引发损 伤后的自我修复阶段；CCl4 慢性肝损伤试验 表明,30～60 d阶段作为脂肪变性期,60～90 d 为肝纤维化形成期。