蛋白质的离子交换层析技术研究进展

以SephadexG，即交联 葡聚糖为骨架
A:阴离子 C:阳离子
凝胶吸水值的10倍 25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克
2.3离子交换剂的分类
琼脂糖
粒径
SepharoseCL-6B 90μm
大孔珠状 SepharoseHP Q型SP型 Sepharose 系列 34μm
123TECHNO SepharoseFF
6.1混合物的分离
蛋白质PEG化程度越高，其等电点越低。 在阳离子交换色谱，PEG化蛋白与介质结合较弱，主要出 现在流穿峰中，通过洗脱液将非PEG化蛋白洗脱下来。而 在阴离子交换色谱中，由于PEG的“屏蔽效应”阻碍了蛋 白与交换剂间的作用，PEG化程度高的蛋白反而易被洗脱。
SP-SepharoseFF分离聚乙 二醇化的rhG-CSF和未反应 的rhG-CSF
+
平衡离子
基质应具备的特点：
机械稳定性强，适合高流速
化学稳定性好，在很宽的pH范围内保持稳定，能耐去污 剂、有机溶剂。
球形，颗粒均匀。
亲水性。 高交换容量，要有较大的孔径。
平衡离子
2.2离子交换剂的指标
实际交换容量指每克干介质或每毫升湿胶包含的带电功能基团的数量 有效交换容量指每克干介质或每毫升湿胶在一定的实验条件下吸附某 交换容量：离子交换剂能结合溶液中可交换离子的能力， 通常用有效交换容量和实际交换容量来表示。 物质的实际容量
层析柱太细

用高径比较小的柱子 过柱前的样品要超声或超滤处理
细小颗粒堵柱
5.2蛋白质不与树脂结合 问题

处理

初始上样缓冲液离子强
降低初始上样缓冲液离子强度
度过大

树脂pH值因解吸作用

注意计算蛋白质的等电点
而发生变化

树脂未进行适当平衡或

树脂应充分平衡或用严格的再生方法
再生的树脂未洗净
5.3纯化蛋白质的产率低 问题
膨胀度：干态的交换剂吸水后造成体积膨胀的程度。 粒径：一般都在3-300μm 粒径↓→分辨率↑，分离效果↑，但流速↓ 交联度及网孔结构：交联度越高，机械强度越好，耐压性 能越好。
电荷密度：基质颗粒单位表面积的取代基数量。对于蛋白 质，介质的电荷密度往往较低。以免结合过牢，难以洗脱 且易变性。
2.3离子交换剂的分类
• 根据活性基团的酸碱性质和解离性质： • 酸碱性质：
类型 名称
英文符号
• 解离性质：
阴离子
阳离子交换剂：活性基团为酸性，结合阳离子 季铵基 Q 阴离子交换剂：活性基团为碱性，结合阴离子 强碱
季铵基乙基 QAE 弱碱 二乙氨基乙基 DEAE
强离子交换剂：活性基团为强酸强碱 磺丙基 SP 强酸 弱离子交换剂：活性基团为弱酸弱碱 磺乙基 SE 阳离子
4.2装柱、平衡
• 装柱：排空柱底部的死体积，轻轻搅匀交换剂与缓冲液的 混合液，玻棒引流，使液体沿柱壁流下，尽可能一次性注 入，让介质自然沉降。 • 保持柱的垂直状态，防止产生气泡、防止分层。 • 平衡：用起始缓冲液平衡，检测下端流出液与起始缓冲液 在pH、电导、离子强度方面是否达一致。 对于弱离子交换剂，本身具有一定的缓冲能力，平衡时间 很长。通常用酸或碱将pH调至起始pH；或用与起始缓冲 液pH相同，但离子强度更大的缓冲液，加快pH平衡，最 后用起始缓冲液平衡。
6.2包涵体蛋白的柱上复性
• 离子交换层析复性rh-IFNγ折叠二聚体 ①A液（6M Urea，50mM PBS，pH7.0）溶解变性的包涵体 蛋白，并用A液平衡SP-SepharoseFF柱。此时，由于高浓 度的变性剂的存在，使rh-IFNγ去折叠并吸附到柱上，单个 蛋白彼此分开。 ②B1液（50mM PBS，pH7.0）和A液混合过柱，形成线性 减少的尿素浓度梯度，以诱使吸附在柱上的蛋白复性，同 时减少复性中间体的聚集。 ③B2液（1M NaCl，50mM PBS，pH7.0）将复性后的蛋白 洗脱下来。 复性后的rh-IFNγ的纯度达 95 % , 蛋白收率达 54 % , 比活 为 7.5 × 105 IU /mg-1
颗粒状 弱型（DEAE， ANXCM） 强型（Q，SP） SepharoseBB Q型SP型 200μm 90μm
Bio-Gel 系列
DE型CM型
2.3离子交换剂的分类
其它
• 高效型：SOURCE系列、MonoBeads系列 刚性的骨架结构：高硬度、高流速 亲水表面：低特异性吸附 • 非孔型：MiniBeads系列 所有的结合都发生在颗粒表面 液膜扩散小，快速；颗粒小，分辨率高 • 聚乙烯醇型：Toyopearl系列 多孔型三维网状结构，富含羟基，高度亲水
弱酸 羧甲基 CM
蛋白质分离纯化时，条件必须温和，通常用弱离子交换剂
2.3离子交换剂的分类
由于树脂的孔径过小，且电荷密度过高，疏水性过强 使得大分子结合过牢而不易洗脱，同时，会造成变性。 通常用于蛋白质的离子交换剂多为纤维素等多糖类。
多糖类

其它

纤维素 葡聚糖 琼脂糖
高效型 非孔型 聚乙烯醇型
4.4洗脱
• -般采用分部洗脱和连续洗脱。 • 分部洗脱：几种不同洗脱能力的缓冲液相继进行洗脱 优点：设备和操作简单；洗脱迅速；洗脱液体积小 缺点：性质相近的组分不易分开；同一组分出现多个峰 • 连续洗脱：逐渐增强洗脱缓冲液的洗脱能力，分辨率↑
梯度混合器
4.5色谱柱的再生与清洗
• 一般，高浓度盐（通常是2M的NaCl）溶液清洗 • 对于一些结合较牢固的物质，如变性的蛋白，沉淀而聚集 的蛋白，疏水性蛋白或脂蛋白等一些胶状物，用酸和碱洗 脱 琼脂糖：盐和0.5M的NaOH 纤维素：盐和0.1M的NaOH 葡聚糖：避免在pH小于3的环境，可用1M的NaAC 0.5M的NaOH交替清洗。 • 疏水性更强的蛋白、脂蛋白以及脂类，用非离子去污剂或 有机溶剂（70%的乙醇或30%异丙醇）逆向清洗。

处理

树脂上的蛋白质未洗净
增强溶液离子强度；更换活性高的反离
子或使用去垢剂等方法解决。

pH值不合适或蛋白质

适当调节PH
发生沉淀

水解酶破坏了目的蛋白

蛋白提取过程中应加水解酶抑制剂抑制
或树脂中有微生物滋生
蛋白水解
5.4蛋白质分辨效果差 问题 处理

流速太快或层析柱过短 梯度洗脱时洗脱液浓度
4.3上样、洗涤
• 上样 加样量：目的物含量为有效交换容量的10-20%。 方法： 预装柱，通过恒流泵加样。 自装柱，采用排干法： 加样时，不能搅动床面，要保持床面的完整。 • 洗涤 加样完后，用起始缓冲液填满柱上端，拧紧上口，用恒流 泵泵入起始缓冲液
4.4洗脱
• 缓冲离子：与功能基团带相同的电荷 • pH：蛋白质的pI→缓冲液的pH→缓冲液的种类 • 离子强度：离子强度↑→利于洗脱，不利于吸附
预处理 装柱、平衡 上样、洗涤 洗脱
色谱柱的再生
4.1预处理
• 预装柱：SOURCE、MonoBeads、MiniBeads系列 无需处理，直接使用。 • 湿胶：无需预处理，使用前倾去上清，添加起始缓冲液， 搅匀后装柱即可 • 干胶：需溶胀。通常室温1-2d，沸水浴2h。 Sephadex系列：不能用蒸馏水，避免强烈搅拌。 纤维素系列： ①制造的过程中，产生一些细颗粒，将纤维素在水中搅 匀后，自然沉降，倾去上清漂浮物，反复数次即可。 ②制造完后，未经处理，含很多杂质成分，需洗涤，用 0.5mol/L的NaOH和0.5mol/L的HCl进行“碱-酸-碱”反 复浸泡，每次半小时，期间用蒸馏水洗至中性。

降低流速 可采用连续洗脱等梯度变化较慢的洗脱
变化太快

上柱蛋白质过多

减少上样量
6.应用实例
6.1
混合物的分离
6Fra Baidu bibliotek2
蛋白质的柱上复性
6.1混合物的分离
• Bio-Rex70层析分离眼镜蛇神经毒素的6种单乙酰基衍生物 眼镜蛇神经毒素，一种小分子碱性蛋白，分子中6个氨基 （5个侧链Lys残基和一个游离的N端氨基）均能被乙酰化 生成乙酰基衍生物,形成的6种单乙酰基衍生物中净电荷数 相同，但表面的电荷分布不同。据此，可以用Bio-Rex70 将它们分开。
2.3离子交换剂的分类
纤维素
• 开放性长链，较大的表面积，吸附容量最大 • 离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗 脱 • 良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广
2.3离子交换剂的分类
葡聚糖
• 目前使用交联葡聚糖主要来自Pharmacia公司，主要有4 种类型，都是以SephadexG为骨架 • 商品名分别为SephadexA-25 SephadexC-25 SephadexA-50 SephadexC-50 SephadexA-25
3.实验条件的确定
3.1
离子交换剂 色谱柱
3.2
3.3
缓冲液
3.1离子交换剂
• 按规模：分析型分离，一般用柱色谱；大规模工业化分离， 有柱色谱、膨胀床吸附、分批分离等多种模式 • 按目的：在预处理和初分级阶段，目的是提取和浓缩目标 分子；在细分级和最后的精制阶段，目的是去除杂质，获 得单一组分。 • 目标分子的大小：选择合适孔径的基质 • 目标分子的电荷及pH稳定性： 在起始缓冲液中，目标分子和介质的功能基团带相反的电 荷，以利于目标分子结合在色谱柱上， 起始相洗脱，杂质和介质的功能基团带相反的电荷，从而 吸附在色谱柱上。这时，收集流穿峰即可。
蛋白质离子交换层析技术
蛋白质离子交换层析技术
1 2 3 4 5 6 离子交换层析原理 离子交换剂 实验条件的确定 具体操作方法 常见问题及处理 应用实例
1.离子交换层析的原理
以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换 剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进 行分离的一种层析方法。 • 蛋白质（以静电引力为主）的离子交换层析 两性分子，不同pH，所带电荷种类和数目不同 高级结构，大分子，多位点吸附 除静电力还有氢键、疏水作用、范德华力等
5.常见问题及处理
5.1
层析速度太慢 蛋白质不与树脂结合 纯化蛋白质的产率低
蛋白质分辨效果差
5.2
5.3 5.4
5.1层析速度太慢 问题 处理
增加柱压并轻敲柱壁的方法以除去气泡，

产生气泡

确保在引入任何溶液时不要产生气泡

树脂基质发生粘连

样品蛋白质损失量允许的情况下，支撑
物应取出并清洗

待分离的目标分子和杂质一起进入平衡后的离子交换剂，目标分子和 杂质因带电量不同，与离子交换剂有不同的结合程度，通过逐渐增加 盐离子浓度，将目标分子和杂质分别洗脱下来，从而实现目标分子和 杂质的分离。
2.离子交换剂
2.1
基本结构 指标
2.2
2.3
分类
2.1离子交换剂的基本结构
水不溶性基质
+
活性基团
3.2色谱柱
• 通常用高径比较小的柱子 离子交换柱的高度一般在5-20cm 确定基本参数后，可通过直径↑→扩大分 离规模。
3.3缓冲液
• 缓冲离子：与功能基团带相同的电荷 • pH：蛋白质的pI→缓冲液的pH→缓冲液的种类 离子强度：离子强度↑→利于洗脱，不利于吸附
4.离子交换的操作方法
4.1 4.2 4.3 4.4 4.5
无孔型，交换发生在表面； 无孔型 有孔型，需进入基质内部再发生交换
有孔型
无孔型
微孔型
大孔型
2.3离子交换剂的分类
其它
• 高效型：SOURCE系列、MonoBeads系列 刚性的骨架结构：高硬度、高流速 亲水表面：低特异性吸附 • 非孔型：MiniBeads系列 所有的结合都发生在颗粒表面 液膜扩散小，快速；颗粒小，分辨率高 • 聚乙烯醇型：Toyopearl系列 多孔型三维网状结构，富含羟基，高度亲水
6.1混合物的分离
• 两步连续离子交换制备色谱分离纯化PEG-rhG-SCF 蛋白质聚乙二醇化的反应，生成非PEG化蛋白和不同程度 的PEG化蛋白的混合物。因蛋白质PEG化程度越高，其等 电点越低，根据电荷量的差异，通过SP-SepharoseFF和 SOURSE Q30作为阳、阴离子色谱连续两步将之分离开来。
SOURSE Q30阴离子交换色谱 分离不同的修饰组分 峰3，2，1分别代表单、双、三 聚乙二醇化蛋白
6.2包涵体蛋白的柱上复性
• 吸附：用变性缓冲液溶解蛋白，用变性缓冲液平衡色谱柱， 使伸展的变性蛋白吸附到介质表面。色谱柱有效分隔蛋白 质分子，抑制分子间的聚集。 • 复性：复性缓冲液相对于变性缓冲液，只少变性剂，其它 成分都一样。变性剂的线性减少能有效抑制复性聚集体的 形成，且利于蛋白在柱上的自发折叠。 • 洗脱：用含高浓度盐的洗脱缓冲液，洗脱折叠后的蛋白。