蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤（待改进）

1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。

2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因 c DNA.

4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、Bl21 codon（DE3）等。

7、蛋白的诱导表达。

1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至

OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25

μM到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上

即有大量表达)。

2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体

蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的

粗大的条带。

动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000

转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.

超声波破碎仪工作30分min要休息5min

（即关闭总电源开关）。

注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降

解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂

（PMSF），PMSF工作浓度为1%。2.如不

能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解

60分钟，60分钟足够裂解。

8、取得上清

1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。

10000rpm，15min，4°离心。沉淀为

包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻

轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。

（此时可以测量一下pH值，pH值最

好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8

左右，裂解后上清就会在7.5左右。）9、纯化上清---摸洗脱条件。

1）镍柱处理。将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，

并将过柱的样品重复上样3次。（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml 的枪将胶体吹散。）取20μl过柱后的样品，以备跑胶。

3）分别加20mM、40mM、60mM、80 mM 的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中，以备跑胶。

注意：理论上是要将收集的溶液测量280nm 处的吸光度，直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗脱了。4）加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。上样量为4.5ml（将前面的0.5ml单独接入EP 管，再将后面的4ml接入另外两个EP管），留跑胶样品。

5）加MES将NI柱重生。MES加10ml，流完后再加10ml Miliq H2O。流完后保存于2倍体积的20%乙醇中，镍柱至少能重复利用6次。（尿素可能对NI柱有损伤。）

注意：所有溶液使用前都要确定其pH是否正

确，pH对挂柱及洗脱影响较大。镍柱所用溶液MES的ph=5.0，其余Equilibration Buffer pH=7.8 ，上清pH=7.5 ，Wash Buffer pH=7.0 ，Elution Buffer pH=7.2。

10、跑胶验证。

1）跑2块0.75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓分离比要相同两块胶才会比较一致。

2）跑胶顺序：负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、E1、E2、MES

3）300V快速压胶5min左右，160V分离样品50min左右。（也可以300V,30min，只是图没有160V好看。）

4）考马斯亮蓝染色。一般染色2h即可。5）脱色。先用脱色剂1脱15min，再用脱色剂2脱过夜。

11、纯化上清---收集目的蛋白

1)将重生的镍柱再次平衡（即加Equilibration

Buffer 3ml）。

2)重复步骤12中的操作，只是wash时只用步

骤12中摸好的咪唑浓度洗。

12、跑胶验证。同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点（用160V），保存好。

13、透析。

1）配制2L透析液（配方见附件1），并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。

2）透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min，用MILIQ H2O充分洗净。3）用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢），将洗脱的蛋白样品加入其中，置入提前预冷的500ml透析液（20mM PBS+50 mM NaCl）中。冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4°冰箱1.5h后换液。透析3次即可。

注意：用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。冰浴以防活性降低。

14、浓缩。

1）将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。

2）30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除，加入新的固体聚乙二醇。

3）每隔10min观察一次，一旦出现浑浊立

即停止浓缩。

4）透析袋用完后，洗净，保存于20%乙醇中4°存放。

注意：浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状，透明度较高，不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。如果看不到，可根据自己估计的蛋白量留1-2ml体积。用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶液分装后-20度保存。

15、超滤法浓缩、透析蛋白。使用超滤法就可省去16、17两步。

1）将4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。

2）配平。

3）7400g，30min，4°离心，结束时4ml变为1ml左右。浓缩4倍。可根据需要选择不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数。可以几次的Elution液一起浓缩。

4）加入需要的蛋白储存液至4ml，离心。重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液。蛋白储存液一般用20mM