HIV抗体检测技术

状 固定在膜上。加待检样品后，阳性结果在膜上抗 原部位显示出 有色斑点。有效试验质控点必须显色。 2 免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线 状 固定在膜上，加待检样品后，阳性结果在膜上抗 原部位显示出 有色条带。有效试验的质控带必须显 色。 3 明胶颗粒凝集试验（PA）：将HIV抗原致敏明胶 颗粒 作为载体，加待检样品后。当待检样品含有 HIV抗体时，明胶颗 粒与抗体发生凝集反应，根据 凝集情况判读结果。
快速诊断试验
快速诊断试剂
（3）免疫层析试验(金标法、硒标法)
以硝酸纤维膜为载体。 加样区：预包被胶体金-抗原/胶体金-protein A结
合物
测试区（T）：固定有重组HIV抗原， 质控区：抗HIV单克隆抗体/抗-protein A抗体
硒标法操作步骤
全血样品
加50ul样品于样品垫中
结合流行病学资料，可以在4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应， 则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进 展，但不满足阳性标准，应继续随访到8周。如带型没有进展或呈阴性反应 则报告阴性；满足HIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准 可视情况决定是否继续随访。
HIV抗体筛查试验
筛查方法

酶联免疫吸附试验（ELISA）
化学发光或免疫荧光试验（CLIA）： 采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪


测定结果。
快速检测（RT）及其它检测试验
(1)明胶颗粒凝集试验(PA) (2)斑点EIA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验 (3)免疫层析试验
(1)酶联免疫吸附试验（ELISA）

样
本 选用初筛试剂
初筛检测 阳性反应 原有试剂＋另一 种原理初筛试剂 重复检测 均阳性反应 送确认 一阴一阳 阴性报告 均阴性反应 阴性报告 阴性反应
HIV抗体筛查检测流程图
筛查试验阳性反应样品
确证试剂
HIV-1 阳性反应 报告HIV-1 阳性
不确定反应
阴性反应
出现HIV-2指示条带
报告阴性
根据具体情况进一步 检测HIV-2
确认试验的试剂：
必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、 在有效期内的试剂。
确认试验方法：
免疫印迹试验(WB)
条带免疫试验(LIATEK HIVⅢ) 放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA)
国内常用的确认试验方法是WB。
HIV抗体确认实验结果
a b c d gp160 gp120 p66 p55 p51

结果便于记录和保存
用途：流行病学监测及临床大量标本的检测
(2)化学发光或免疫荧光试验
采用发光或荧光底物，既可检测抗体，也
可联合检测抗原抗体。
HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检
样品和酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加 发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结 果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合 试剂盒规定。

可使用血液、唾液、尿液样品 单纯HIV抗体检测试剂


HIV抗原抗体联合检测试剂：同时检测血液中
HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。


HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品
和酶标记的HIV抗原或抗体，加底物显色，用酶标仪

测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。
间接法检测抗体
HIV抗体确证检测流程图
HIV抗体检测的要点
1、根据目的选择检测方法及检测策略。 2、严格遵守实验室SOP。 3、筛查试验阳性，须作确证实验。 4、筛查试验阴性，不应做确证实验。 5、筛查及确证试验阳性均应做好咨询工作。
HIV 抗体检测不能用来诊断 ：

HIV 急性感染 新生儿HIV 感染
婴幼儿HIV感染的抗体检测
快速诊断试剂
（1）明胶颗粒凝集试验（PA）
将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样
品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待
检样品含有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗
粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒
在孔中的凝集情况判读结果。
PA法原理
PA法操作步骤
PA法
快速诊断试剂
（2）斑点EIA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）
注意:不同厂家、不同方法临界值计算公式不同
cutoff=NC+0.1
cutoff=NC*2.1
四代艾滋病酶联免疫试剂比较
solid phase conjugate specific detection of IgG 抗体 HIV-1 method
第一代
病毒裂解液 HIV-1
-IgG抗体
间接
第二代

谢谢！
HIV抗体检测
行业标准:
《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》WS298-2008
技术规范:
《全国艾滋病检测技术规范》（ 2009年修订版）
HIV抗体检测程序

筛查试验
–初筛
–复检

确证试验
பைடு நூலகம்
筛查试验
筛查试剂 必须是经国家食品药品监督管理局

注册批准、在有效期内的试剂，其中
酶联免疫试剂应批批检合格。推荐使用 临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。 血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液。
适用范围： HIV感染产妇所生婴幼儿；已满18 个月的婴幼儿，其母亲HIV感染状态 不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床 怀疑HIV感染的儿童。 婴儿应于12个月进行HIV抗体检测，结果 阴性则排除感染，纳入正常儿童保健； 阳性者继续追踪随访，至18个月再次进行 HIV抗体检测，结果阴性排除感染。
酶标二抗 标本（含抗体） 固相抗原 E
E
底物
E
双抗原夹心法检测抗体
E
固相抗原
底物
标本（含抗体）
酶标抗原 E
E
ELISA法结果判断
临界值概念: 将检测的阳性和（或）阴性对照的OD值
代入计算公式计算出来的判断阳性和阴性结果的界值
判断标准:标本OD值与临界值的比值大于等于
1(S/CO≥1)为阳性（对间接法及双抗原夹心法）
HIV抗体检测技术

艾滋病病毒的形态
HIV颗粒
HIV的逆转录酶缺乏3’—5’核酸外切酶活性 ， 无法修复逆转录和复制过程中发生的错误 。
HIV生活周期
吸附－穿入－脱壳－生物合成－组装成熟和释放
HIV-1通过gp120与靶细胞表面CD4分子和趋化因子受体结合
HIV感染后的血清学改变
艾滋病诊断的特殊性
手指血方法
15分钟内读取结果
加一滴缓冲液
静脉血方法
质控条 病人条
快速诊断试验
快速诊断试剂
优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急 诊检测。不需专门设备和人员培训,一般可在 10～30分钟内得出结果。 缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保 存。
注意：一定要将试剂平衡至室温
HIV抗体确认试验
gp41 p39
p31 P24 p17
血清对照 HIV-2特异带
a 强阳性对照（HIV-1和HIV-2） b弱阳性对照（HIV-1） c阴性对照 d典型的HIV-2血清阳性反应
HIV核酸定性检测
规定了核酸检测、核酸序列测定的实验室条件、
检测方法及结果判定标准
结果报告 ：
HIV核酸检测阴性:只可报告本次实验结果阴性。
病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2
IgG抗体
IgG 抗体 HIV-1 / -2
间接
第三代
病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O 病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 Ab
病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O
（3）快速检测（RT）及其它检测试验
优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊 急 诊检测。不需专门设备, 人员培训简单,一般可在10～30分钟内得出结 果。 缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易 保存。
HIV快速检测试剂按原理不同，分为以下三类： 1 免疫渗滤试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点
HIV P24抗原的检测
适用范围：
★HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断； ★ HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助
鉴别诊断； ★第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳 性反应，但HIV-1抗体确认阴性者的辅助诊断； ★监测病程进展和抗病毒治疗效果。
检测方法：通常是采用ELISA双抗体夹心法。
IgM / IgG 抗体 HIV-1 / -2 / -O
夹心
第四代
病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 抗体
IgM / IgG 抗体 HIV-1 / -2 / -O p24 抗原
夹心
酶联免疫吸附试验（ELISA）
优点：准确性高、价格低廉、
判断结果标准客观、
HIV核酸定量检测的意义
辅助诊断：当RNA测定出现较高拷贝数的阳性结果


时（>3，000c/ml），感染发生的可能性非常大。 应综合其它检测数据和样品背景情况进行综合判断。 早期诊断 ：HIV感染孕妇所生婴儿 、↓残余危险度 病程监控 ：确定疾病发展的阶段，以确定相应的治 疗方案。 指导治疗方案及疗效判定 ：通常在治疗前后病毒水 平降低0.5 log以上才被认为临床有效。 预测疾病进程
HIV抗体筛查样品

初筛试验 对呈阴性反应的样品，可出具 HIV抗体阴性（-）报告； 对呈阳性反应的样品，需要进一步 做复检试验和确证试验。
复检试验 对初筛呈阳性反应的样品，应使用 原有试剂和另外一种不同原理（或厂家） 的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家 的试剂进行复检试验。 如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，则复检必 须包括一种抗原抗体联合试剂。 艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样 品，确证实验室可以直接进行确证试验。
HIV核酸检测阳性:可作为诊断HIV感染的辅助指 标，不单独用于HIV感染的诊断。
严格的实验室管理制度（分区、仪器和材料的专
用、单向流向、废弃物处理）
HIV RNA定量测定（病毒载量测定）
方法
常用的HIV RNA定量测定方法有逆转录PCR试验（RTPCR）、核酸序列扩增试验（NASBA）、分支DNA杂交试 验（bDNA）。
以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状固定在膜上,加血
清样品。
斑点EIA法用酶标记抗体，以后步骤同ELISA。 斑点免疫胶体金（或胶体硒）用红色的胶体金（或胶
体硒）A蛋白标记，用渗滤法作为洗涤方法。
阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间
在10 min以内，使用抗原量少。
金标诊断试验原理
结果报告和解释
HIV-1 P24抗原的阳性结果必须经过中和试 验确认，若阳性标本的OD值比中和反应前减 少50%以上，才确定为HIV P24抗原结果阳 性。 HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染窗口期的 辅助诊断依据，不能据此确诊。 HIV-1P24抗原检测的敏感性为3090％，低 于病毒载量测定。HIV-1P24抗原阴性结果只 表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染。

高度依赖实验室诊断
HIV检测的严肃性：
保证输血、器官移植的安全
错误结果将导致严重的法律问题

结果严格保密
HIV抗体检测目的
– 诊断：确定个体HIV感染状况而进行的检测， – 包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、
根据特殊需要进行的体检等。
– 监测：了解不同人群HIV感染率及其变化趋势 – 而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群 – 和一般人群。 – 血液筛查：防止输血传播HIV而进行的检测， – 包括献血员筛查和原料血浆筛查。