分子克隆的步骤及原理

分子克隆的步骤及原理

基本原理

克隆开始前至少需要两个重要的DNA分子。首先，您需要要克隆的DNA片段，也称为插入片段。它可以来自原核，真核，灭绝的生物，也可以在实验室中人工创造。通过使用分子克隆，我们可以更多地了解特定基因的功能。

其次，你需要一个矢量。载体是用作分子生物学工具的质粒DNA，用于制备更多拷贝或从某种基因产生蛋白质。质粒是载体的一个例子，是由细菌复制的圆形，染色体外的DNA。

质粒通常具有多克隆位点或MCS，该区域含有不同限制性内切核酸酶的识别位点，也称为限制酶。可以通过称为连接的技术将不同的插入物掺入质粒中。载体质粒还含有复制起点，使其可以在细菌中复制。另外，质粒具有抗生素基因。如果细菌整合了质粒，它将在含有抗生素的培养基中存活。这允许选择已经成功转化的细菌。

将插入物和载体克隆到宿主细胞的生物体中，最常用于分子克隆的是大肠杆菌。大肠杆菌生长迅速，可广泛获得并且具有许多可商购的不同克隆载体。真核生物，如酵母，也可用作载体生物。

一般分子克隆方法的第一步是获得所需的插入物，其可以来自任何细胞类型的DNA或mRNA。然后根据插入物的类型选择最佳载体及其宿主生物，最终将用它完成。聚合酶链式反应或基于PCR的方法通常用于复制插入物。

然后，使用一系列酶促反应，将消化插入物连接在一起并引入宿主生物体中以进行大量复制。从细菌中纯化重复的载体，并在限制性消化后，在凝胶上分析。然后将在凝胶上纯化的片段送去测序以验证该奖章是所需的DNA片段。

操作过程

(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA 片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。

(2)载体DNA的选择：

①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核

生物基因文库，cDNA库和次级克隆。

②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。

M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F 基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。

③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体－质粒混合物。此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。

(3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA 片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产

生相同末端。②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。④人工接头分子连接，在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。

连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA 片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。

(4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。

(5)克隆的选择：

①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效

地将重组分子与本底区分。例如：有些λ噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化，如蓝色变为无色；有些λ噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子。

②间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。

③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。

④免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。