免疫印迹法的实验技术

印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体 上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种 方法。
Western Blot 印迹方法，是检测蛋白质混合 液体中某种特定目的蛋白的定性方法，也可作为 确定同一种蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不 同条件下的相对含量的半定量方法。
实验主要内容：
注意事项
玻璃板要清洁,对齐卡严，防止漏胶。 丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经毒性并容 易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故称量或配胶时应戴 手套及口罩 . 过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制. 溶液中一旦加入TEMED，应立即混匀并快速灌注入玻璃 夹槽中 . 浓缩胶缓冲液(PH为6.8)、分离胶缓冲液(PH8.8)， PH值要准确。 胶灌入前要充分混匀，灌胶要缓慢,避免有气泡的产生. 为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的电泳上 样缓冲液. 正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证蛋白由 上向下方向电泳。
根据待测样品的蛋白质分子量选择分离胶和浓缩胶的浓度. （一般浓缩胶为5%，分离胶根据所测蛋白分子量定）
凝胶浓度（％）
Hale Waihona Puke 线性分离范围（KD)15 10
12-43 16-68
7.5
5.0
36-94
57-212
作用
浓缩胶：当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽 的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动 界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物 向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶， 使样品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚 集成一条很薄的区带（或称积层）（0.51cm）。
凝胶电泳
样品的印迹
免疫学检测
实验步骤 提取细胞或组织蛋白→测定蛋白
含量→制备SDS-PAGE胶→蛋白 变性、上样→电泳→ 转膜→封闭 →一抗→TBST洗膜→HRP标记 的二抗→TBST洗膜→ECL底物显 色→X光片曝光、显色→结果分析
二、蛋白样本的制备和浓度的测定
蛋白的提取：一般包括组织蛋白提取、细胞蛋白 的提取 组织蛋白提取 组织和裂解液（加入蛋白酶抑制剂，为防止细胞 内蛋白酶对蛋白质的降解）按比例配制-置于玻璃 匀浆器中，充分研磨（冰上操作）4℃离心， 12000rpm，10min取上清分装1.5ml离心管 中－20℃保存。（低温和蛋白酶抑制剂可以减少 蛋白的降解。） 蛋白酶抑制剂：如PMSF、EDTA、EGTA等，要根据具
实验前的准备 设备和材料的准备: 转移电泳槽的准备(本实验用垂直电泳 槽)、转移电泳仪的准备、膜、滤纸、海绵 垫、玻璃棒 试剂的准备和配置:电转液、甲醇（PVDF 膜）、（考马斯亮蓝染色液、丽春红染色 液）
根据待测样品的蛋白质分子量选择转移的电流大 小及时间.我们通常 200mA/膜，按照目的蛋白 分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据 实际适当调整。 目的蛋白分子大小(kDa) 80---140 25---80 15—40 <20 胶浓度 8% 10% 12% 15% 转移时间(h) 1.5-2.0 1.5 0.75 0.5
四、转 膜
蛋白质印迹法就是将电泳后分离的蛋白质从凝胶 中转移到固相支持物上。 常用的固相支持物有NC （硝酸纤维素）膜、尼 龙膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜。 PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸 附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性，价 格比NC膜要贵。NC膜更常用。
附： 膜的选择主要根据： 膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积 的膜能结合蛋白 的载量） 膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）有两种规格： 0.45um和0.2um（for MW<20kDa)。 不影响后续的显色检测（也就是适合用于所选显 色方法）
分离胶：由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛 状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小， 起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以 分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最 终达到彼此分开。(PH为8.8)
组装SDS-PAGE凝胶用玻璃槽 ↓ 配制和灌注分离胶 ↓ 用水压线30-40分钟直至分离胶凝固 ↓ 倒掉压线水配制和灌注浓缩胶 ↓ 插入样品梳 ↓ 凝胶直至浓缩胶凝固 ↓ 制备样品
② 正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正 极流动。接通电源，恒压状态下转膜（此步操作 宜在4℃进行）。 ③小心取出转移膜，做好标记，在1×TBST液中 漂洗两次。 （用考马斯亮蓝快速染色液处理凝胶，检查蛋白 转移是否完全,用丽春红染色液膜,检测蛋白质是 否转移到膜上.）
打开转膜夹板，由阴极侧 海绵垫片→3层滤纸→样品凝胶 → NC膜→三层滤纸（排除气泡）→海绵垫片阳极侧
转膜通常有两种方法：毛 细管印迹法和电泳印迹法。 电泳印迹效率更高。这种 方法是用有孔的塑料和有 机玻璃板将凝胶和硝酸纤 维素膜夹成"三明治"形状， 而后浸入两个平行电极中 间的缓冲液中进行电泳， 选择适当的电泳方向就可 以使蛋白质离开凝胶结合 在膜上。转移后的膜就称 为一个印（blot），用于 对蛋白质的进一步检测。
蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴 定; 蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至 会影响此电泳方法的分辨力。
方法：
目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、双缩 脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法 （Lowry法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法 Bradford法）。
目前实验室测蛋白浓度都用试剂盒，如BCA法试 剂盒.
说明： 不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有 些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构 象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些 结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷， 因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷 的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是 35,000。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互 相验证。 有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰 凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚 基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只 是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了 得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的 数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。
实验步骤
NC膜预处理：（剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入 1×转移缓冲液平衡5分钟以上。注意：必须保证NC膜始 终完全浸于转移缓冲液中，裁剪时要戴手套，避免手上蛋 白将膜污染。） 剪裁6层滤纸，比胶略大，用转移缓冲液浸泡后待用，同 时4层海绵垫也用转移液浸泡。 取胶：撬开玻璃板，将多余的胶切除，把裁好的胶放人转 移液中。 转膜 ① 制作“三明治”：由夹子的黑板（阴极）侧开始，依 次为黑板→海绵垫片→3层滤纸→胶→NC膜→三层滤纸 （注意：排除气泡）→海绵垫片(阳极)，扣紧转膜夹板， 放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中（见蛋白质转移示意 图）。
体情况具体选择。
注意事项
注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼 睛及皮肤，一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，立即 用大量水冲洗。 所用离心机需提前预冷。 为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。 吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。
蛋白浓度的测定 原因： Western Blot作为一项半定量实验技术， 电泳前，必须对不同的样品进行总蛋白含 量测定。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳， 被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色” 用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品， 转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固 相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电 泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相 载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体 起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起 反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分 离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也 广泛应用于检测蛋白水平的表达。
SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶 电泳法。
原理
1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决 于分子大小和形状以及所带电荷多少。 2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫 酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋 白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，在一 定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合（1.4gSDS/1g 蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度 的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量， 从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋 白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其 它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
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免疫印迹法的实验技术
（Western Blot 印迹方法）

一、Western-Blot简介
Western Blot，又称为免疫印迹 （Immunoblot）,是70年代末80年代初发 展起来的蛋白质测定技术。
蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大 学的乔治· 斯塔克（George Stark）。在尼 尔· 伯奈特（Neal Burnette）于1981年所 著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。
样品:上样缓冲液=4:1,混匀1000C加热5分钟,离心取上清)
实验步骤
↓ 拔出样品梳 ↓ 加入电泳缓冲液,上样，电泳 ↓ 电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止
夹心式垂直电泳槽
蛋白变性的原因
上样蛋白为蛋白样本和上样缓冲液的混合 物，按比例配制，100℃煮5min。 其目的是将SDS 与蛋白质充分结合，以使 蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构 同时使整个蛋白带上负电荷。
实验前的准备
设备和材料的准备: 电泳槽的准备(本实验用垂直电泳槽)、电泳仪的 准备、离心机、电磁炉、煮锅、移液枪、枪头、 烧杯、量筒 试剂的准备和配置: 双蒸水、30%丙烯酰胺、Tris-HCl(PH为 8.8)、Tris-HCl(PH为6.8)、10%SDS、 10%过硫酸铵(AP)、TEMED、电泳上样缓冲 液、电泳缓冲液、蛋白Marker
实验用途
用于检测样品中特异性蛋白质是否存 在。
对特异性蛋白质进行半定量分析。
蛋白免疫印迹组成
1
SDS -聚丙烯酰 胺凝胶电泳，使 待测样品中的蛋 白质按分子量大 小在凝胶中分成 带
2
把凝胶中已分成 条带的蛋白质转 移到一种固相支 持物上
3
用特异性的抗体 检测出已经印迹 在膜上的所要研 究的相应抗原
BCA法工作原理
BCA(bicinchoninic acid 二辛可酸)法测定蛋白 质的原理与Lowery法相似。即在碱性环境下蛋白 质分子中肽键结构与Cu2+络合并将Cu2+还原 成Cu1+。BCA特异地与Cu1+结合形成稳定的 紫蓝色复合物，在562 nM处有最大光吸收值并 与蛋白质浓度成正比，颜色的深浅与蛋白质的含 量成正比，可以根据吸收值测定蛋白质浓度。该 测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的 颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质去垢剂 等影响小。
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实验原理
实验用途 实验方法及步骤
实验注意事项
实验原理

将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶
【SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDSPAGE)】电泳使蛋白质按分子量的大小进行分离
→ 凝胶上分离到的蛋白质转移至固相支持物 （硝酸纤维素膜或PVDF 膜）上 → 用抗靶蛋白 的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进 行特异性结合→与经辣根过氧化物酶标记（偶联） 的二抗结合 →用ECL发光或DAB显色检测。如 果转印膜上含有靶蛋白，经DAB显色后上出现 棕黄色条带蛋白条带。