人慢性髓系白血病细胞;K562贴壁培养
芬苯达唑对慢性髓系白血病K562细胞的增殖抑制作用
芬苯达唑对慢性髓系白血病K562细胞的增殖抑制作用贺立彩;史柳芝;巩瑞;杜转运;顾海华;吕建新【摘要】目的:探讨抗寄生虫药芬苯达唑对慢性髓系白血病细胞K562的作用及机制.方法:采用CCK-8法检测芬苯达唑对K562和正常人外周血单个核细胞(PBMC)生长的影响;台盼蓝拒染实验检测芬苯达唑对K562细胞活力的影响;瑞氏染色观察芬苯达唑对K562细胞形态的影响;流式细胞术检测芬苯达唑对K562细胞周期分布的影响;Western blot检测芬苯达唑对K562细胞周期相关蛋白表达的影响;免疫荧光观察芬苯达唑对K562细胞核的改变.结果:芬苯达唑能够显著抑制K562细胞的生长,而对PBMC生长无明显影响;进一步的研究发现,芬苯达唑显著抑制K562细胞增殖并诱导细胞发生G2/M期阻滞;芬苯达唑处理K562细胞后,细胞分裂周期蛋白25C(Cdc25C)磷酸化、周期素依赖性激酶1(Cdk1)-Tyr15去磷酸化以及cyclin B1磷酸化增加;免疫荧光结果证实芬苯达唑诱导K562多核细胞增多(P<0.01),发生有丝分裂灾难.结论:芬苯达唑通过调控周期相关蛋白诱导K562细胞发生G2/M期阻滞.%AIM:To investigate the effect of fenbendazole (FBZ) on the proliferation of human chronic myelogenous leukemia (CML) cell line K562.METHODS:The CCK-8 assay was used to detect the effect of FBZ on viability of the K562 cells and normal peripheral blood mononuclear cells (PBMC).The cell growth was measured by the method of Trypan blue exclusion.The cell cycle was analyzed by flow cytometry.The cell cycle-related proteins were detected by Western blot.RESULTS:The growth ofK562 was significantly inhibited by FBZ.However, it elicited little cytotoxic effect on PBMC.Furthermore, FBZ induced G2/M phase arrest and mitotic catastrophe in the K562 cells based on the changes of nuclear morphology,DNA content, mitotic marker analysis and the number of polykaryocytes.CONCLUSION:Fenbendazole significantly inhibits the proliferation of K562 cells and induces cell cycle arrest at G2/M phase by the regulation of cell cycle-related proteins.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2017(033)006【总页数】5页(P1012-1016)【关键词】芬苯达唑;慢性髓系白血病;增殖抑制;G2/M期阻滞【作者】贺立彩;史柳芝;巩瑞;杜转运;顾海华;吕建新【作者单位】温州医科大学检生学院,浙江温州 325035;温州医科大学检生学院,浙江温州 325035;温州医科大学检生学院,浙江温州 325035;温州医科大学检生学院,浙江温州 325035;温州医科大学检生学院,浙江温州 325035;温州医科大学检生学院,浙江温州 325035【正文语种】中文【中图分类】R733.72慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是血液系统干细胞起源、造血祖细胞驱动的骨髓恶性增殖性疾病[1]，90%以上患者存在特征性的费城染色体，即t(9;22) (q34;q11)染色体易位，形成BCR/ABL融合基因[2]。
敲低去泛素化酶USP13抑制K562细胞的增殖
中国生物工程杂志China Biotechnology,2021，41 (5) : 1-7D01：10. 13523/j.cb.2101041i研究报告ts t敲低去泛素化酶USP13抑制K562细胞的增殖+陶守松1任广明2尹荣华2杨晓明马文兵葛志强(1天津大学化工学院制药工程系天津300072 2中国人民解放军军事科学院军事医学研究院生命组学研究所北京100850) (3中国人民解放军军事科学院军事医学研究院卫生勤务与血液研究所北京100850)摘要目的：研究去泛素化酶USP13对人慢性髓系白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响，并进 行初步的机制探究。
方法：构建pLKO.l-shUSP13-GFP慢病毒干涉载体，慢病毒包装后感染并建立稳定敲低USP13的K562细胞株。
免疫印迹检测K562细胞中USP13蛋白的敲低效率。
流式细 胞术分析敲低USP13对K562细胞增殖和凋亡的影响。
免疫共沉淀和蛋白质泛素化实验探究USP13调控K562细胞的分子机制。
结果：成功构建pLKO.l-shUSP13-GFP慢病毒干涉载体，同时 利用慢病毒体系获得稳定敲低USP13的K562细胞株。
流式细胞术结果显示，敲低USP13促进K562细胞凋亡、抑制细胞增殖。
分子机制研究发现，敲低USP13通过增强c-Myc泛素化进而导致 其蛋白质水平降低u结论：初步揭示了 USP13调控K562细胞增殖和凋亡的分子机制，为治疗慢 性髓•系白血病提供了潜在的把点。
关键词人慢性髓系白血病K562细胞 USP13 增殖和凋亡 c-Myc中图分类号Q814慢性髓系白血病（chronic myelogenous leukemia, CML)是由于基因突变导致酪氨酸激酶B(_r-Abl持续磷 酸化产生的一种克隆性骨髓恶性增生性疾病。
临床特 点是产生大量不成熟的白细胞,进而抑制骨髓的正常 造血功能[1]。
酪氨酸激酶Bcr-Abl激活多种信号通路，的发生发展。
K562细胞培养
K562细胞培养实验实验人员：刘嵘、郝茜、张寅峰、龙琪实验材料：K562细胞，无菌RPMI-1640培养基，无菌离心管，无菌吸管，无菌培养瓶，离心机，倒置显微镜，超净工作台，CO2培养箱。
培养基成分：培养液由90%不完全1640培养液[RPMI-1640液95毫升；0.1M丙酮酸钠1毫升；0.2M谷氨酰胺1毫升；1M HEPES 1毫升；7.5%NaHCO3 1毫升；青霉素、链霉素（各一万单位）1毫升]和10%灭活胎牛或新生牛血清。
细胞培养操作：一、细胞冻存与复苏：细胞冻存实验步骤1、将细胞悬液收集至离心管中。
2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。
3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。
4、将悬液分至冻存管中，每管1ml。
5、将冻存管口封严。
如用安郶瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。
冻存管外拴一金属重物和一细绳。
7、按下列顺序降温：室温→4o C(20分钟)→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（-30o C 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮细胞复苏实验步骤：1、取出贮存细胞，37o C水浴中快速融化。
2、把1-2ml冻存细胞加入到大约25ml完全生长培养基，轻轻混匀。
3、以大约800rpm离心2到3分钟，弃去上清。
4、在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。
5、细胞铺板，细胞接种应该至少为3×105活细胞/ml。
二、细胞培养与传代：1、将细胞培养液转移到离心管中，离心800-1000rpm,5min。
2、去除上清。
3、加入1ml培养基到离心管内，用吹打使细胞悬浮。
4、将细胞悬液吸出，加入到已加入8ml培养基的新的已灭菌培养瓶中。
5、在倒置显微镜中观察瓶中细胞密度是否适中6、旋开半圈培养瓶口，放入CO2培养箱中培养7、观察并适时传代实验结果：b)细胞传代一次时间：其中，第四代（5.20上午-5.22晚上）细胞密度低，生长繁殖时间最长；第五六和第八代细胞生长繁殖一代耗时时间最短，且最终细胞密度也最大，以致培养基变黄。
小剂量K562细胞成功建立NOD_SCID小鼠白血病的病理模型
κB、mTOR、Par-4、p21等 [10]。
在本研究中发现PESV 能显著降低K562细胞的PI3K，p-Akt的表达，有一定的时间依赖性。
两个蛋白的表达随PESV作用时间的延长下调更为明显,与其诱导凋亡的效应相一致，其效应均优于环磷酰胺。
说明PESV较好的抑制了PI-3k/Akt信号转导途径及该通路作用的下游通路，从而通过影响调控因子促进K562细胞的凋亡。
由此，可以认为慢粒患者造血干细胞的恶性转化可能是通过BCR/ABL 融合蛋白P210 表达，激活信号传导途径，影响下游因子，发挥抑制细胞凋亡的作用。
慢性粒细胞白血病的发病机制提示我们通过研制新的酪氨酸激酶抑制因子，抑制蛋白酶体或通过作用于BCR/ABL下游的靶向信号途径[11],对慢性粒细胞白血病的治疗可能是一个新的有效的途径。
本研究在一定程度阐明中药全蝎提取物PESV促进慢性粒细胞白血病细胞的凋亡，干预PI-3K、p-Akt信号蛋白的表达，进而起到调控下游信号因子的表达，促进人慢性粒细胞白血病细胞K562细胞凋亡的作用。
小剂量K562细胞成功建立NOD/SCID小鼠白血病的病理模型郝征7 杨文华 于文俊 张佳NOD/SCID（非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷）小鼠是在SCID（重症联合免疫缺陷）小鼠的基础上与非肥胖性糖尿病小鼠（NOD/Lt）品系回交的免疫缺陷鼠[1]。
NOD/SCID小鼠既有先天免疫缺陷,又有T和B淋巴细胞缺乏,各种肿瘤细胞可以植入，且较少发生排斥反应及移植物抗宿主病(GVHD)，所以NOD/SCID小鼠已成为血液学实验研究的有用工具。
人白血病细胞株注射于NOD/SCID小鼠体内，可以在外周血、脾脏、淋巴结等处检测到并长期存在，各类白血病细胞及杂交瘤细胞均能在其体内迅速增殖。
本研究取白血病人K562细胞系尾静脉接种到NOD/SCID小鼠体内，观察建立NOD/SCID小鼠白血病模型病理组织变化。
1.材料和方法1.1实验动物及预处理SPF级NOD/SCID小鼠，3-4周龄，雌雄各半，购于中国医学科学院实验动物研究所，饲养于中国医学科学院血液学研究所动物实验中心SPF级层流室，标准颗粒饲养，饮水酸化处理，垫料及一切与鼠接触物品均灭菌处理。
Western blot检测白血病细胞的凋亡
Western blot检测白血病细胞的凋亡摘要】目的探讨Westen blot即蛋白免疫印迹法检测慢性粒细胞白血病（CML）细胞系K562细胞经过物理及化学因素（饥饿和伊马替尼）处理后，出现凋亡现象。
方法应用Western blot技术、细胞培养、蛋白质提取和定量以及凋亡的始动及执行因子Caspase-3(全长和活化)作为一抗体，羊抗兔辣根过氧物酶偶联IgG(H&L)作为二抗来检测CML细胞系K562细胞凋亡情况。
结果应用Western blot检测肿瘤细胞即K562细胞出现凋亡同时Caspase-3有高表达。
【关键词】 Western blot K562细胞凋亡 Caspase-3【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）17-0246-01K562胞是慢细性粒细胞白血病细胞（CML）系，90%的CML患者染色体异位t（9，22）导致染色体病变[1]，基因突变形成活性失控酪氨酸激酶BCR-ABL融合基因，该基因表达P210蛋白促发一系列信号转导通路，从而导致CML的发生。
K562细胞是属于悬浮细胞，跟大多数肿瘤细胞相似，生长增殖很快。
Westernblot又称蛋白免疫印迹，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
Western blot常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析[2]。
Caspase特异性蛋白酶是一组与细胞因子成熟和细胞凋亡有关的蛋白酶，从1992年人类第一次纯化Caspase-1克隆并测序其DNA[3]。
目前已发现的哺乳动物的caspase酶共有14种，其中Caspase-3在传递细胞凋亡过程中是被激活的关键激酶，它是传递细胞凋亡信号的主要效应因子[4]。
并可水解各种细胞成分而使细胞出现凋亡[5]在本研究中，我们应用伊马替尼诱导k562细胞凋亡，伊马替尼是CML治疗的一次革命变革[6]运用上述方法探究K562细胞出现凋亡的机制，从而达到治疗慢性粒细胞白血病分子靶向治疗的新靶点。
桂皮醛诱导K562细胞分化增强Mel18表达
桂皮醛诱导K562细胞分化增强Mel18表达刘黎琼;刘泽林;王欣;王淡瑜;崔海燕;金梦迪【摘要】目的探讨桂皮醛对慢性髓细胞白血病细胞株k562的诱导分化作用及其机制.方法以低浓度桂皮醛(30 μmol/L、60 μmol/L)作用于体外培养的K562细胞,流式细胞术检测桂皮醛作用前后K562细胞分化抗原和Mel18表达,western blot 检测K562细胞c-Myc表达.结果低浓度桂皮醛作用后K562细胞表面单核细胞分化抗原CD11b和CD14表达呈剂量依赖性增加,Mel18荧光明显增强,c-Myc表达明显下降.结论低浓度桂皮醛可诱导K562细胞向单核细胞分化,Mel18表达增加在桂皮醛诱导K562细胞分化中发挥重要作用.【期刊名称】《河北医药》【年(卷),期】2011(033)014【总页数】2页(P2133-2134)【关键词】桂皮醛;K562细胞;细胞分化;Mel18【作者】刘黎琼;刘泽林;王欣;王淡瑜;崔海燕;金梦迪【作者单位】518052,广东省深圳市第六人民医院(南山医院)血液科;518052,广东省深圳市第六人民医院(南山医院)血液科;518052,广东省深圳市第六人民医院(南山医院)血液科;518052,广东省深圳市第六人民医院(南山医院)血液科;518052,广东省深圳市第六人民医院(南山医院)血液科;518052,广东省深圳市第六人民医院(南山医院)血液科【正文语种】中文【中图分类】R965恶性肿瘤的诱导分化治疗已成为目前肿瘤生物学和肿瘤治疗学的前沿领域和研究热点，尤其是中药提取物的诱导分化研究是热点中的热点。
桂皮醛是食用香料肉桂提取物的主要活性成分，具有安全无毒特点。
桂皮醛可对多种恶性肿瘤调亡发挥抑制增殖、诱导凋亡的效应，我们的前期研究也显示桂皮醛可诱导慢性粒细胞性白血病细胞株K562凋亡，但尚无桂皮醛诱导分化效应研究的报道［1－3］。
本实验观察桂皮醛诱导K562细胞分化改变及探讨相关机制，以进一步研究桂皮醛抗肿瘤的机制。
细胞培养心得
1、寄运细胞或者接收细胞，都要做好充足的准备;如果是让其它实验室寄运细胞，或者寄给别人细胞，细胞应该如何处理是主要考虑的问题。
假设细胞在途中要经过48小时，那么可以待细胞长到50%的密度时处理细胞，即将细胞培养瓶内加满培养液，拧紧瓶盖，用封口膜封紧瓶口；然后将培养瓶放进泡沫盒，用纸或泡沫将盒内空间填满，使培养瓶不能随意移动。
同时将泡沫盒钻上几个孔，使空气可以流通。
因此要确定准备好以下物品：透气的细胞培养瓶；封口膜；足量的培养液；放细胞培养瓶的泡沫盒及填充物；除了细胞的处理，还要注意以下几点：1）提前跟快递公司人员联系，要上门取货（大多快递公司都可以，顺丰确实算是好些；近来觉得韵达速度也很快）2）时间安排（细胞处理尽量安排在下午，因为快递公司一般来说都是晚上统一发货，要是早晨处理细胞交给快递公司，细胞还没上路呢，就已经在培养箱外待了一天）；接收细胞就容易多了，提前准备好细胞培养用耗材及培养用液就可以了，紫外灯先打开，收到细胞将培养瓶中大部分培养液吸掉，留下4-5ML培养液（针对25cm2的培养瓶）；培养一天后，观察细胞状态，确实是传代还是换液。
总而言之，运送细胞讲究两点：1离开了培养箱要防止被污染2尽量缩短细胞不在培养箱的时间，不然时间过久细胞长满脱落就没得救了。
2要讲的是MTT试验，这个纯粹讲个人经验，因为我本身的考虑可能就是错的，所以非常欢迎提出疑问以及批评指正。
1）细胞的铺板：以96孔板为例，做细胞实验的同学看文献可能注意到，有较多的文献中提到细胞接种数量是5000个/孔；最初我也是按照这个数量来铺板的，实际上这个接种数量偏高；假设给药时间是48小时，发现空白对照孔中会有细胞无法贴壁，因为太满了，被挤出来了。
如此，则会因为接种密度原因，而不能准确反映细胞的正常生长情况及给药组作用情况。
即使是给药时间为24小时，仍然会出现类似情况。
因此，我后期实验中接种细胞数量为3000-4000，如果是药物作用48小时，最好是3000cells/每孔，空白对照孔细胞在加MTT前也就刚好长满，后来才发现别人也很多按照这个数量接种的，只是提醒需要注意，不要盲目的按照5000这个密度，还有的是100，基本上不靠谱。
异甘草酸镁对慢性髓细胞性白血病K562细胞系增殖的抑制作用
【 摘要 】 目的 ： 观察异甘草 酸镁 对慢性髓 细胞 白血病 Ｋ５ ２ ６ 细胞 系增殖的抑制作 用。方法 ： 将异甘 草酸镁 以 １４ 培养液倍 比 ６０ 稀释成 １ ，１ １～ １ ～ １ 一 ０ １ ～ ０ ・。 ８ 浓度 组 ， ０ ， ０ ， ０ ， ０ ，１ ， ０ ，１～ｇＬ 共 个 分别处理增殖期 Ｋ５ ２ ６ 细胞 ， 下观察 不 同时 间点各浓度组 镜
ｕｎ ｒｍ ｉｒ ｓ ｏ ｅ． ｄｅ ｃ ｏ ｃ ｐ ＣＣＫ一 ｓ ｙ ｗ ａ ｍ ｐｌｙｅ ｏ ｄ ｔｃ ｈ ｂｉｉ ｏ ｅｌｐｒ ｉｅ ａ ｉｎ ａ ｏ ｈ ｕｒ ｅ ｗａ ｏ ｕｃ ｄ ｆ ｒｃ ｌｕｌｔｎ ８ａｓａ ｓ ｅ ｏ ｄ ｔ ｅｅ ｔｔ ｅ ａ ｌｙ ｆｃ ｌ ｏｌｆｒ ｔｏ ｎｄ ｇ ｗ ｔ ｒ ｔ ｃ ｖ ｓｐｒ ｄ ｅ ｏ ａｃ ａ ｉｇ
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性。其 中， ０ｇＬ 和 １ ・。 １ ・。 Ｌ 异甘草酸镁 的抑制 作用最强（ ｇ Ｐ＜００ ） Ｉ 约为 １ ・‘ ．１ ， Ｃ ． ｇＬ。 ６ 。结论 ： 异甘草 酸镁 对Ｋ５ ２ ６ 细胞的增
殖具有抑制作 用 ， 为临床应 用异甘 草酸镁 预防和治疗 白血病化疗相 关肝损伤提供 实验依据 。
Ｉ 关键 词ｌ 异甘草 酸镁 ； 慢性 髓细胞性 白血病 ； ６ 细胞 ； Ｋ５ ２ 细胞增 殖 Ｉ 中图分类 号ｌ ６ Ｒ９ ５ ｌ 文献标识码 ｌ Ａ Ｉ 文章编号 １ ６ ２ １ ７２ １）５ ２ ９ ３ １ ７ —８ ５ （０ ００ —０ ７ —０
丝裂霉素诱导人白血病K562细胞凋亡的研究
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第 ３ 卷 第 ３期 ２
２ １ 年 ５ 月 ０２
高 师 理 科 学 刊
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Grb2的抑制对K562细胞侵袭和迁移能力的影响
Grb2的抑制对K562细胞侵袭和迁移能力的影响姚娜;刘枋;王凌燕;陈慧菁;陈淑萍;叶韵斌【摘要】Objective To study the effect of inhibition of Grb2 expression level on K562 cell inva sion and migration by RNA interference. Methods Eukaryotic expression vector pSilence-4. 1CMV-Grb2 was constructed and stably transfected into chronic myelognous leukemia cells K562 using lipofectamine, K562/pSilence-4. 1CMV-Grb2 cell lines stably expressing Grb2 siRNA -were established -with hygromycin selection. The downregulation of Grb2 by stable expression of Grb2 siRNA -was confirmed by Western blot and RT-PCR. Cell migration and invasion was monitored by transwell assay. Results Three cell lines with Grb2 siRNA stable expression were established, including K562/pSilence-4. 1CMV-Grb2/4O5, K562/pSilence-4. 1CMV-Grb2/541 and K562/pSilence-4. 1CMV-Grb2/215. Grb2 mRNA and protein ex pression levels in K562/pSilence-4. 1 CMV-Grb2/405 cells -were down-regulated and a decrease in cell mi gration and invasion was observed in these cells. Conclusions Downregulation of Grb2 in K562 cells could lead to a decrease in cell migration and invasion. Our results suggest that gene therapy targeting Grb2 by siRNA may inhibit tumor metastasis.%目的探讨Grb2的抑制对K562细胞侵袭和迁移能力的影响.方法 pSilence-4.1CMV-Grb2原核表达载体的构建并应用脂质体介导法将其转染至人慢性髓细胞性白血病细胞K562,后以潮霉素筛选稳定表达siRNA的细胞克隆.应用Western blot和RT-PCR技术,检测转染Grb2 siRNA重组质粒的K562细胞(K562/pSilence-4.1CMV-Grb2)、转染空载体细胞(K562/pSilence-4.1CMV)和未转染细胞(K562)中Grb2的表达情况.Transwell小室体外迁移和侵袭能力实验测定各组细胞的迁移和侵袭能力.结果成功构建了pSilence-4.1CMV-Grb2原核表达载体,并获得稳定表达siRNA原核载体的细胞株K562/pSilence-4.1CMV-Grb2/405、K562/pSilence-4.1CMV-Grb2/541及K562/pSilence-4.1CMV-Grb2/215;与其他组比较,K562/pSilence-4.1CMV-Grb2/405细胞Grb2 mRNA和蛋白的表达水平显著降低并伴随着其迁移和侵袭能力的下降.结论 Grb2的抑制可明显降低K562细胞侵袭和迁移能力.提示针对Grb2的siRNA有望成为抑制肿瘤转移的基因治疗的一种新途径.【期刊名称】《福建医科大学学报》【年(卷),期】2011(045)006【总页数】5页(P404-408)【关键词】K562细胞;连接蛋白类;受体,生长因子;RNA干扰;细胞运动;肿瘤侵润【作者】姚娜;刘枋;王凌燕;陈慧菁;陈淑萍;叶韵斌【作者单位】福建医科大学,教学医院、福建省肿瘤医院,肿瘤免疫学研究室、福建省肿瘤转化医学重点实验室,福州,350014;福建医科大学,教学医院、福建省肿瘤医院,肿瘤免疫学研究室、福建省肿瘤转化医学重点实验室,福州,350014;福建医科大学,教学医院、福建省肿瘤医院,肿瘤免疫学研究室、福建省肿瘤转化医学重点实验室,福州,350014;福建医科大学,教学医院、福建省肿瘤医院,肿瘤免疫学研究室、福建省肿瘤转化医学重点实验室,福州,350014;福建医科大学,教学医院、福建省肿瘤医院,肿瘤免疫学研究室、福建省肿瘤转化医学重点实验室,福州,350014;福建医科大学,教学医院、福建省肿瘤医院,肿瘤免疫学研究室、福建省肿瘤转化医学重点实验室,福州,350014【正文语种】中文【中图分类】R392.11;R394;R733.72生长因子受体结合蛋白－2（the growth factor receptorbound protein－2，Grb2）是胞内主要的接头蛋白。
电穿孔转染K562细胞的效率研究_窦立萍
养。 24 h 后于荧光显微镜下观察 , 取 5 个不同视野 分别计数表达增强型绿色荧光蛋白的细胞和总细胞 数, 计算感染效率。 感染效率 ( % ) = 荧光显微镜下细胞数 /总 细胞 数 100 %。
[ 基金项目 ] 国家基础研究 973 项目 ( 2005CB522400) ; 国家自然科学 基金 ( 30572108 ) [ 作者简介 ] 窦立萍 , 女 , 军 医进修 学院博 士毕业 , 医师。 E-m ai:l l ip ingdou@ yahoo . com. cn [ 通讯作者 ] 于力 , 教授 , 主任。 E-m a i:l chunhu iliyu@ yahoo. com
军 医 进 修 学 院 学 报 A cad J PLA Postgrad M ed S ch
2008 O ct , 29 ( 5)
421 g 质粒加入 脂质体方法等。脂质体转染 是目前常用的 转染方 法, 其特点为操作简单、 方便, 但目的基因表达时间 短, 转染效率低。电穿孔技术具有可重复性、 高效、 大量样本处理、 无毒性以及不需要孵育时间等优点, 对传统转染效率低的细胞可能具有较好的效果。 GFP ( green flu orescent protein) 是 存 在于 水 母 Aequoreav ictoria 中的一种天然荧光蛋 白, GFP 在各 种异源细胞中表达后 , 不需要任何外加酶或底物便 可在合适的激发光激发下发出绿色荧光 , 作为报告 基因具有观察方便、 直观并能对活细胞进行观察的 优点 , 在生命科学领域得到广泛应用 。 本实 验 显 示, 采 用 目 前 常 用 的 L ipofectam ine 2000 转染试剂转染 K562 细胞转染效率较低, 不能 达到常规实验的要求, 电转染方法可以达到 10 %的 转染效率 , 可以满足部分实验的需求。但电穿孔法 导致 K562 细胞凋亡率较高, 对于研究外源基因对 转 染进 K562 细胞凋亡的影响不宜采用。
大蒜素对人白血病细胞系K562细胞增殖和凋亡的影响
大蒜素对人白血病细胞系K562细胞增殖和凋亡的影响目的探讨大蒜素对人白血病细胞系K562细胞增殖和凋亡的影响及其机制。
方法体外培养的K562细胞，用不同浓度大蒜素处理24、48、72h，MTT法测定其对K562细胞增殖的影响；大蒜素（浓度分别为3、6、12μg/mL）处理K562细胞48h后，分别采用流式细胞仪检测细胞凋亡、Rh123探针染色流式细胞仪检测线粒体膜电位变化、分光光度计检测Casepase-3、Casepase-9相对活性、western blot法检测环氧合酶2（COX-2）表达情况。
结果大蒜素（浓度2~32 μg/mL）能抑制K562细胞的增殖，呈剂量和时间依赖性；大蒜素（浓度分别为3、6、12 μg/mL）作用K562细胞48 h后，细胞凋亡率分别为11.5%、21.4%、36.6%，对照组凋亡率为2.2%；Casepase-3、Casepase-9相对活性显著增加；COX-2的表达降低，呈剂量依赖性。
结论大蒜素能抑制K562细胞的增殖并诱导其凋亡，其作用机制可能与下调COX-2基因的表达、增加细胞Casepase-3、Casepase-9活性及降低线粒体膜电位有关。
大蒜素是一种前景广阔的抗肿瘤药物。
标签：大蒜素；K562细胞；Caspase-3；Caspase-9；环氧合酶-2大蒜素（Allicin）是大蒜中最重要的有效成分，其具有广泛的生物学作用，包括抗菌、抗炎、抗血栓、降血压、降血脂、降血糖、调节免疫力等。
流行病学表明，大蒜素的摄入能减少多种肿瘤的发生［1］；动物和细胞实验研究证实，大蒜素在体内外对多种肿瘤包括皮肤癌、肺癌、肝癌、结肠癌、食管癌、胃癌及前列腺癌等均有抗肿瘤作用［2］。
为探讨大蒜素对血液系统肿瘤的的影响及其机制，本研究以人白血病细胞系K562细胞为对象，观察大蒜素对人白血病细胞系K562细胞增殖、凋亡的影响，并检测大蒜素对K562细胞线粒体膜电位、Caspase-3、Caspase-9活性变化及western blot检测环氧合酶-2（COX-2）蛋白表达的影响。
人白血病细胞K562增殖的作用
人白血病细胞K562增殖的作用白血病是造血系统的恶性肿瘤，其特征是骨髓、淋巴结等造血系统中一种或多种血细胞成分发生恶性增殖，并浸润体内各脏器组织，导致正常造血组织细胞受抑制，产生各种症状。
目前，对于此类疾病的治疗主要采取传统的化疗手段，标准的化疗方案仅能使40%~60%患者获得暂时缓解，中位生存期一般不超过3a。
大剂量化疗联合造血干细胞移植可使缓解率明显提升，但除了极少数患者以外，其余大多数仍难免会复发，其显著的不良反应使得患者的生活质量和治疗信心受到严重影响。
因此，寻找高效低毒的治疗药物，显得尤为重要。
我们以K562细胞作为研究对象，探讨力达霉素（LDM）抗白血病的可能机制。
1材料K562细胞（本室保存）；LDM（由中国医学科学院医药生物技术研究所甄永苏院士惠赠）；RPM-1640（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Biological公司）；MTT（噻唑蓝）法检测细胞增殖及细胞毒性试剂盒（南京凯基）；苔盼蓝；兔抗人肿瘤坏死因子（TNF-α）抗体（美国Affinity公司）；Betaactin（β肌动蛋白）抗体（美国Affinity公司）2方法2.1细胞培养K562细胞株从液氮中复苏后，用含10%胎牛血清的RPM-1640培养液在37℃，5%CO2恒温培养箱中培养，所有实验均采用对数生长期细胞。
2.2细胞增殖的检测在96孔板加入细胞100μl/孔（约1×104），置37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24h后，加入不同浓度力达霉素（LDM），再于恒温培养箱孵育48h，加入50μlMTT，37℃孵育4h，使MTT还原为甲臜，1000g离心，吸出上清，每孔加入150μl二甲亚砜（DMSO）使甲臜溶解，平板摇床摇匀，于490nm波长处检测每孔的吸光度（A）值，计算细胞成活率。
2.3细胞的计数离心收集K562细胞，制备单细胞悬液并作适当稀释，细胞悬浮液与台盼蓝溶液以9∶1混合混匀，在3min内分别计数活细胞和死细胞，计算活细胞率。
SRB法与MTT法细胞计数应用比较
第１５卷第１７期２００５年９月中国现代医学杂志ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｄｅｍＭｅｄｉｃｉｎｅＶ０１．１５Ｎｏ．１７Ｓｅｐ．２００５文章编号：１００５—８９８２（２００５）１７—２６１５－０３ＳＲＢ法与ＭＴＴ法细胞计数应用比较周思朗ｔ，屈艳妮ｚ，张健，，汪森明１，张积仁１（１．南方医科大学珠江医院肿瘤中心，广东广州５１０２８２；２．广州市民政局精神病院，广东广州５１０４０７）·论著·摘要：目的比较ＳＲＢ（ＳｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅＢ）法与ＭＴＴ法细胞计数的灵敏】生与稳定性。
方法取４种不同类型细胞系指数生长期细胞，调整细胞密度为１Ｘ１０６，并按比例稀释为０．０７８—１０Ｘ１０ｓ细胞梯度。
分别用ＳＲＢ法与ＭＴＴ法测量各细胞梯度吸光度（Ａ），分析其与相应细胞数目的相关性。
ＳＲＢ法与ＭＴＴ法各随机取１００个Ａ值，测量其在２、１６、２４ｈ和７ｄ后的Ａ值，比较这两种方法的稳定性。
结果ＳＲＢ法与ＭＴＴ法测定的Ａ值与不同细胞系细胞数目均有极好的相关性；ＳＲ＿Ｂ法的测定结果几乎不随时间而变，而ＭＴＴ法的测定结果受时间影响较大。
结论ＳＫＢ法相对于ＭＴＴ法是进行大规模细胞计数与细胞生长曲线测定前途更加光明的实验方法。
关键词：ＳｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅＢ；ＭＴＴ；密度；生长曲线；细胞系中图分类号：Ｑ８１３．１文献标识码：ＡＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎＳＲＢｗａｙａｎｄＭＴＴｗａｙａｐｐｌｙｉｎｇｔｏｃｏｕｎｔｃｅｌｌｓｉｎｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅＺＨＯＵＳｉ－ｌａｎ９１，ＱＵＹａｎ－ｎｉ２，ＺＨＡＮＧＪｉａｎｌ，ＷＡＮＧＳｅｎ－ｍｉｎ９１，ＺＨＡＮＧＪｉ－ｒｅｎｌ（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｅｏｐｌａｓｍ，ＺｈｕｊｉａｎｇＨｏｓｉｐｉｔａｌ，ｔｈｅＳｏｕｔｈＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ５１０２８２，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ；２．ＴｈｅＴｈｉｒｄＤｉｓｔｒｉｃｔｏｆＭｅｎ，ｔｈｅＡ￥＃ｕｌｎｏｆＧｕａｎｇｚｈｏｕＣｉｖｉｌＡｆｆａｉｒｓＢｕｒｅａｕ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，ＤｉｓｔｒｉｃｔＧｕａｎｇｄｏｎｇ５１０４０７，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】ＴｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｓｕｓｅｅｐｔｉｖｅｎｅｓｓａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎＳｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅＢａｓｓａｙａｎｄＭＴｒａｓｓａｙ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｔｈｅｃｅｌｌｓｄｅｎｓｉｔｙｏｆ４ｃｅｌｌｌｉｎｅｗｅｒｅａｄｊｕｓｔｅｄｔｏｌｘｌ０６ｂｙＲＰＭＩ１６４０．ＴｈｅｎｃｅｌｌｓＷａｓｄｉｌｕｔｅｄｔｏａｃｅｒｔａｉｎｄｅｎｓｉｔｙｉｎｏｒｄｅｒａｓ５ｘ１０ｓ，２．５ｘｌ＆，１．２５ｘ１０５，６．２５ｘｌｌＹ，３．１３ｘｌ∞１．５６ｘ１０４ａｎｄ０．７８ｘ１０４．Ｔｈｅｎ：Ｔｈｅｃｅｌｌｓｏｆｅｖｅｒｙｃｅｌｌｓ－ｄｅｎｓｉｔｙ－ｇｒａｄｉｅｎｔｆｒｏｍｅｖｅｒｙｃｅｌｌｌｉｎｅｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＳｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅＢａｓｓａｙａｎｄＭＴｒａｓｓａｙ．ＴｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｂｅｔｗｅｅｎＡｖａｌｕｅｆｒｏｍＳｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅＢａｓｓａｙａｎｄＭＴｒａｓｓａｙａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｃｅｌｌｄｅｎｓｉｔｙｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．ＴｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＡｖａｌｕｅｂｅｗｅｅｎｔｗｏａｓｓａｙｂｙａｓｓｅｓｓｉｎｇｔｈｅＡｖａｌｕｅｖａｒｉａｎｃｅｂｅ－ｗｅｅｎＡｖａｌｕｅｆｒｏｍ０ｈｏｕｒａｎｄ２ｈｏｕｒ，１６ｈｏｕｒ，２４ｈｏｕｒｏｒ７ｄａｙｓ．【Ｒｅｓｕｌｔ】ＡｓｔｈａｔｆｒｏｍｔｈｅＭＴｒａｓｓａｙ，ｔｈｅＡｖａｌ－ＨｅｆｒｏｍｔｈｅＳＲＢａｓｓａｙｗａｓａｃｃｏｒｄｗｉｔＩｌｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｃｅｉｌｓｄｅｎｓｉｔｙｉｎａｌｌｃｅｌｌｌｉｎｅ．ＢｕｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｆｒｏｍＭＴｒａｓｓａｙ，ｔｈｅＡｖａｌｕｅｆｒｏｍｔｈｅＳＲＢａｓｓａｙｈａｄｌｅｓｓｅｆｆｅｃｔｓｂｙｔｈｅｔｉｍｅｖａｒｉａｔｉｏｎ．【Ｃｏｎｃｌｕｔｉｏｎ】Ｃｏｍｐａｒｅｄ试ｔＩｌｔｈｅＭＴｒａｓｓａｙ，ｔｈｅＳＲＢａｓｓａｙｉｓａｂｅｔｔｅｒｗａｙｔｏｃａｌｃｕｌａｔｅｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅａｎｄｔｏｅｓｔｉｍａｔｅｔｈｅｅｅｎｓｄｅｎｓｉｔｙｗｈｅｎｔｈｅｓａｎｌ－ｐｉｅｓｉｚｅｉｓｖｅｒｙｌａｒｇｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｕｆｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅＢ：ＭＴｒ；ｄｅｎｓｉｔｙ；ｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅ；ｃｅｌｌｌｉｎｅ细胞计数是测量培养细胞生长曲线的基础，也是细胞培养技术中一项耗费时间精力比较大的步骤。
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人慢性髓系白血病细胞；K562贴壁培养
细胞名称：人慢性髓系白血病细胞；K562
形态特性：淋巴母细胞样
生长特性：悬浮生长
培养条件：RPMI1640(w/o Hepes)+10%FBS
传代方法：维持细胞浓度在1×105~2×106cells/ml；2~3天换液1次
冻存条件：基础培养基+8%DMSO+20%FBS
特征特性：该细胞是由Lozzio从一名53岁的慢性髓细胞性白血病急变期的女性患者的胸水中分离建立的。
该细胞曾被认为来源于粒系，处于高度未分化阶段；Anderson等人作了细胞膜特性的研究后，认为该细胞是红白血病细胞系。
该细胞是对自然杀伤细胞高度敏感的体外靶标，故而被广泛应用于这方面的研究。
K562的原始细胞是一种具有多向分化潜能的造血系统的恶性肿瘤细胞，能自发分化为红系、粒系和单核系的可辨识的祖细胞。
该细胞表达CD7（25％）。
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.将细胞转移至50mL的无菌离心管中，1000rpm离心5-10min，用完全培养基重悬细胞，适宜的密度分
瓶培养。
注意：
我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养）
1.收到细胞后请尽快更换为含10%FBS的新鲜培养基。
2.如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时拍照并联系售后。
3.细胞任何售后问题，均需拍照存档并在2周之内及时联系客服。